第18章重組DNA技術(shù).ppt

1、第十八章 重組DNA技術(shù) Chapter 18 Techniques of Recombinant DNA, DNA分子體外重組技術(shù)和核苷酸序列分析技術(shù)標(biāo)志了基因工程時(shí)代的誕生。, 1973年，Herbert Boyer和Stanley Cohen首次成功 實(shí)現(xiàn)DNA分子的體外重組。, 1977年，F(xiàn)rederick Sanger 和 Walter Gilbert 發(fā)明了DNA測(cè)序法。, 重組DNA技術(shù) (recombinant DNA technique)：指在體外重新組合DNA分子，并使它們?cè)谶m當(dāng)?shù)募?xì)胞中增殖的遺傳操作。, 遺傳工程(Genetic Engineering)：借助生物學(xué)技術(shù)

2、，對(duì)生物遺傳物質(zhì)進(jìn)行更改和/或重新組合，以改變生物的遺傳性狀或創(chuàng)造新的生物品種的遺傳學(xué)研究技術(shù)。, 遺傳工程有廣義和狹義之別，狹義遺傳工程專指重組DNA技術(shù)(即基因工程)，廣義遺傳工程包括細(xì)胞水平的遺傳操作(也稱細(xì)胞工程)和基因工程。, 克?。菏怯⑽摹癱lone ”或“cloning 的音譯，源于希臘文“Klone”，本意為無(wú)性繁殖系，即通過(guò)無(wú)性繁殖而產(chǎn)生的完全相同的子代集合體。,重組DNA技術(shù)的基本步驟,第 一 節(jié) 重組DNA技術(shù)中的酶 Section 1 Enzymes in DNA Recombination,重組DNA技術(shù)中常用工具酶,一、限制性核酸內(nèi)切酶(restriction en

3、zyme ),1. 定義 限制性內(nèi)切酶：又稱限制性核酸內(nèi)切酶，能識(shí)別結(jié)合雙鏈DNA分子中的特異序列，并切割DNA。,3. 限制酶的分類 根據(jù)作用特征可以分為型、型和型三種類型 (1) 三型限制酶的基本特征, 型：具有內(nèi)切酶和甲基化酶的雙重活性，作用需ATP供能，能識(shí)別和結(jié)合于特定的DNA序列位點(diǎn)，但隨機(jī)切斷在識(shí)別位點(diǎn)以外的DNA序列（通常在識(shí)別位點(diǎn)周圍400700bp）。, 型：具有內(nèi)切酶和甲基化酶的雙重活性，作用需ATP供能，切割位點(diǎn)距離識(shí)別位點(diǎn)約25bp。,(2) 型限制性核酸內(nèi)切酶, 只由一條肽鏈組成，不具有甲基修飾酶活性， 不需要ATP 識(shí)別位點(diǎn)一般為4 6堿基對(duì)組成的特異性序列。 切

4、割后可產(chǎn)生粘性末端，也可產(chǎn)生平頭末端。,二、DNA連接酶(DNA ligases), 常用的連接酶為T4連接酶，既可以連接粘性末端，也可以連接平頭末端。, 溫度是影響連接反應(yīng)效率的重要因素，通常在426進(jìn)行連接反應(yīng)。,不同類型的限制性內(nèi)切酶的切點(diǎn)性質(zhì)以及粘端之間的退火,第二節(jié) 載 體 Section 2 Vectors, DNA載體：是指具有接受外源DNA片段并能導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行自主復(fù)制的特定DNA分子。, 克隆載體用于克隆基因或DNA片段的載體。 用于表達(dá)一個(gè)基因則稱為表達(dá)載體。 載體的特點(diǎn)：,(1)含有復(fù)制起始點(diǎn) (2) 體積小,(3) 不能插入到基因組中，易于分離和純化 (4) 含有選擇

5、性標(biāo)記 (5) 含有克隆位點(diǎn) (5) 具有適當(dāng)?shù)拈L(zhǎng)度, 表達(dá)載體則除了上述特征外，還應(yīng)在所要表達(dá)的基因上游具有轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，下游有轉(zhuǎn)錄終止子等；很多表達(dá)載體還具有核糖體結(jié)合位點(diǎn)。,一、克隆載體,1. 質(zhì)粒載體 通常為天然質(zhì)粒的人工改良DNA。 (1) pBR322,為最早發(fā)展的常用克隆載體之一，具有如下特點(diǎn)： 帶有一個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn) 具有Ampr和Tetr二個(gè)抗性基因，可插入失活 具有較小的分子量(4.36kb) 可插入較大外源片段 (6kb) 拷貝數(shù)較高(可達(dá)10003000),質(zhì)粒pBR322示意圖,(2) pUC系列質(zhì)粒 由pBR322改建而成，主要特征為：, 有復(fù)制起始位點(diǎn)(ori，源于p

6、BR322) Ampr基因(酶切位點(diǎn)不再單一) 含有Lac Z基因 含有多克隆位點(diǎn)區(qū)段, pUC系列大多數(shù)是成對(duì)的，如pUC8/pUC9、 pUC18/pUC19,pUC18/19質(zhì)粒的基本結(jié)構(gòu), pUC系列質(zhì)粒的優(yōu)點(diǎn)： 具有更小的分子量和更高的拷貝數(shù) 適應(yīng)于組織化學(xué)篩選重組體(藍(lán)白斑實(shí)驗(yàn)) pUC系列提供多克隆位點(diǎn)(MCS),2噬菌體載體, 常用于大片段DNA的克隆，實(shí)驗(yàn)中以噬菌體、M13和粘粒最為常用,3. 人工染色體, 人工染色體(artificial chromosomes)：由染色體的復(fù)制元件構(gòu)建的載體，是為克隆更大片段的DNA而發(fā)展的新型載體。, 人工染色體主要包括三種：細(xì)菌人工染

7、色體(BAC)、酵母人工染色體(YAC)和哺乳動(dòng)物人工染色體(MAC), YAC載體的復(fù)制元件包括：復(fù)制起點(diǎn)序列(即自主復(fù)制序列，ARS)、著絲粒(centromere , CEN)和兩個(gè)端粒(TEL)。,二、表達(dá)載體,根據(jù)表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)： 原核表達(dá)載體 酵母表達(dá)載體 昆蟲細(xì)胞表達(dá)載體 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體 植物細(xì)胞表達(dá)載體等,1. 原核表達(dá)載體,(1) 原核表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)： 強(qiáng)啟動(dòng)子 常用啟動(dòng)子：Lac啟動(dòng)子、Trp啟動(dòng)子、T7噬 菌體啟動(dòng)子 轉(zhuǎn)錄終止子： T7終止子等 SD序列：提供核糖體的結(jié)合位點(diǎn),(2) 原核表達(dá)載體表達(dá)特點(diǎn)： 非融合型表達(dá)蛋白 融合型表達(dá)蛋白 分泌型表達(dá)蛋白,

8、T7啟動(dòng)子,Lac操縱序列,rbs (SD序列),T7終止子,MCS,His標(biāo)簽,His標(biāo)簽,凝血酶位點(diǎn),pET-28a-c(+) 克隆表達(dá)區(qū)結(jié)構(gòu)特征,2. 酵母表達(dá)載體, 一般為質(zhì)粒型穿梭載體。, 選擇性標(biāo)志, 通常利用營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變作為篩選的標(biāo)記，如常用的：URA3、LEU2、HIS3和TRP1。, 復(fù)制子, 通常利用啤酒酵母2m環(huán)質(zhì)粒的復(fù)制起始序列。, 常用的啟動(dòng)子,常用的酵母基因啟動(dòng)子：醇脫氫酶、磷酸甘油酸激酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶、蔗糖酶、酸性磷酸酯酶和酵母交配因子(MF)。,(1) 酵母表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)特點(diǎn), 上游活性序列, 上游活性序列的功能類似于增強(qiáng)子，可促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。, 終止序列,

9、 可終止轉(zhuǎn)錄，還可增加mRNA的數(shù)量和蛋白質(zhì)表達(dá)的總量。, 特定蛋白結(jié)構(gòu)域, 如信號(hào)肽序列和核定位序列等。,(2) 酵母表達(dá)載體的表達(dá)形式, 直接表達(dá), 分泌性表達(dá), 外源蛋白質(zhì)表達(dá)后積累于酵母細(xì)胞質(zhì)中，如人乙型肝炎表面抗原的表達(dá)。, 外源蛋白質(zhì)表達(dá)后在信號(hào)肽指導(dǎo)下分泌至細(xì)胞外，信號(hào)因子通常為因子前導(dǎo)序列，Invitrogen公司的酵母表達(dá)載體pGAPZ屬于此種類型。,3. 哺乳動(dòng)物表達(dá)載體, 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)外源蛋白的優(yōu)勢(shì)是可被修飾。, 常用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)宿主： 中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO) 猴腎細(xì)胞(COS)等, 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體一般為穿梭型載體，含有真核細(xì)胞表達(dá)相應(yīng)序列，如Invi

10、trogen公司開發(fā)的pcDNA3.3-TOPO。,哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pcDNA3.1,第 三 節(jié) 重組DNA操作的基本過(guò)程 Section 3 Protocols of DNA Recombination,DNA重組的基本過(guò)程： 1. 靶基因DNA片段的制備 2. 適宜載體的選擇和制備 3. DNA片段與載體的連接 4. 重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞 5. 含有重組DNA宿主菌的篩選 6. 重組DNA分子的鑒定,基因組DNA,質(zhì)粒載體,限 制 酶,目的基因序列,重組后含有外源基因的載體,DNA 連接酶,轉(zhuǎn)化,擴(kuò)增,重組DNA技術(shù)的基本步驟,一、目的DNA片段的制備, 來(lái)源與方法：基因組DNA、cDN

11、A、PCR產(chǎn)物和化學(xué)合成的DNA。, 基因文庫(kù)(gene library)：也稱基因組文庫(kù)(genome library)，用限制酶切割基因組DNA獲得成千上萬(wàn)的在一定大小范圍內(nèi)的DNA片段，每一個(gè)DNA片段與載體分子連接，產(chǎn)生一個(gè)重組DNA分子的混合物，重組DNA分子轉(zhuǎn)化宿主菌后，每一個(gè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞含有一個(gè)重組DNA分子，這些克隆的集合體被稱為基因文庫(kù)。,基因組文庫(kù)的構(gòu)建, cDNA文庫(kù)(cDNA library)：提取細(xì)胞總mRNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得總cDNA，每一個(gè)cDNA分子與載體連接產(chǎn)生了一個(gè)重組DNA分子的混合物，再轉(zhuǎn)化宿主菌，每個(gè)宿主菌細(xì)胞克隆將含有一個(gè)cDNA重組分子，這些克隆的集合體

12、被稱為cDNA文庫(kù)。, 若目的序列全部已知，可以通過(guò)人工合成的方法獲取靶序列。, 已知目的序列兩端序列時(shí)，可以通過(guò)PCR方法獲取靶序列。,cDNA文庫(kù)的構(gòu)建,二、載體的選擇與準(zhǔn)備, 選擇原則：依據(jù)重組DNA的目的，選擇適當(dāng)載體。,適合的選擇標(biāo)記,三、DNA分子的體外重組, 互補(bǔ)性粘性末端將使連接更容易。,限制酶粘性末端連接 T-載體粘性末端連接 平末端連接 同聚物加尾連接 人工接頭連接,Bam H切割反應(yīng),T4 DNA連接酶 15C,限制酶粘性末端連接,目 錄,目 錄,平末端鏈接,3. 同聚物加尾連接 在末端轉(zhuǎn)移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物

13、序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。,載體DNA,目的基因,限制酶或機(jī)械剪切,限制酶,目 錄,4. 人工接頭(linker)連接 由平端加上新的酶切位點(diǎn)，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接。,人工接頭及其應(yīng)用,目 錄,四、重組DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞,1. 轉(zhuǎn)化, 轉(zhuǎn)化(transformation)：質(zhì)粒DNA分子導(dǎo)入細(xì)菌宿主，并使其獲得新表型的過(guò)程。,三種方法：轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染和感染。, 感受態(tài)細(xì)胞(competent cell)：指經(jīng)過(guò)處理后變得更容易接受外源DNA的細(xì)菌細(xì)胞。如使用CaCl2處理E. coli細(xì)胞，可獲得E. coli的感受態(tài)細(xì)胞。,2. 轉(zhuǎn)染, 轉(zhuǎn)染(transfe

14、ction)：將重組DNA分子轉(zhuǎn)入真核細(xì)胞的過(guò)程。, 轉(zhuǎn)染細(xì)胞：接受了外源DNA分子的宿主細(xì)胞。, 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染(stable transfection)：進(jìn)入宿主細(xì)胞的DNA分子整合到宿主細(xì)胞基因組中。, 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染(transient transfection)：進(jìn)入宿主細(xì)胞的DNA分子游離于宿主染色體之外。, 轉(zhuǎn)染方法：常用磷酸鈣法和脂質(zhì)體法。,3. 感染, 感染(infection)：以病毒或噬菌體為載體的重組DNA分子，在體外經(jīng)過(guò)包裝成具有感染能力的病毒或噬菌體顆粒，感染適當(dāng)?shù)募?xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增，也稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)。,五、重組子的篩選與鑒定,1. 載體的抗藥性標(biāo)志,抗

15、氨芐青霉素基因(Ampr) 抗四環(huán)素基因(Tetr) 抗卡那霉素基因(Kanr)等,2. 載體抗藥性標(biāo)志插入失活選擇, 一般選用含有兩個(gè)以上抗藥基因的載體，外源DNA插入其中一個(gè)抗藥基因，并導(dǎo)致該基因失活。如pBR322質(zhì)粒含有Ampr基因和Tetr基因(BamH I)。,(插入失活法) 抗藥性標(biāo)記選擇,目 錄,3.-互補(bǔ)法 (即藍(lán)白斑篩選法),質(zhì)粒 -肽 (無(wú)半乳糖苷酶活性),-肽-肽 (半乳糖苷酶活性),宿主 -肽 (無(wú)半乳糖苷酶活性),X-gal,X (藍(lán)色產(chǎn)物),+ gal(半乳糖), 互補(bǔ)的檢測(cè),組氨酸缺陷 型大腸桿菌,無(wú)組氨酸 的培養(yǎng)基,酵母咪唑甘油磷 酸脫水酶基因,促進(jìn)組氨酸合成

16、,DNA,重組體,4. 營(yíng)養(yǎng)缺陷型的互補(bǔ)篩選,5. 核酸分子雜交篩選, 通過(guò)原位雜交、Southern 印跡和 Northern印跡分析轉(zhuǎn)化子。,根據(jù)插入序列設(shè)計(jì)探針,與轉(zhuǎn)化子克隆進(jìn)行雜交,有雜交信號(hào)的為陽(yáng)性克隆,6. PCR法進(jìn)行鑒定,根據(jù)插入序列設(shè)計(jì)PCR引物,以轉(zhuǎn)化子的重組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,電泳分析PCR產(chǎn)物,根據(jù)PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度判斷陽(yáng)性克隆，還可結(jié)合PCR產(chǎn)物測(cè)序進(jìn)行更精確的分析,7. DNA序列分析鑒定, 直接進(jìn)行DNA測(cè)序，精確分析陽(yáng)性克隆。, 對(duì)陽(yáng)性重組轉(zhuǎn)化子的精確鑒定一般先選擇前6種方法之一進(jìn)行初步分析后，再進(jìn)行DNA測(cè)序分析。,第 四 節(jié) 外源基因的蛋白質(zhì)表達(dá) Sec

17、tion 4 Expression of Recombinant Gene, 重組基因表達(dá)體系的創(chuàng)建過(guò)程包括： 表達(dá)載體的構(gòu)建 受體細(xì)胞的建立 表達(dá)產(chǎn)物的分離、純化等技術(shù)。, 根據(jù)宿主細(xì)胞的不同可分為： 原核表達(dá)體系 真核表達(dá)體系,一、原核表達(dá)體系,1. 不同表達(dá)方式的優(yōu)缺點(diǎn),(1) 非融合型表達(dá) 優(yōu)點(diǎn)：與真核生物體內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)最相似，功能 最相近。 缺點(diǎn)：容易被細(xì)菌蛋白酶所破壞。,(2) 融合型表達(dá) 優(yōu)點(diǎn)：可以抵御細(xì)菌蛋白酶的破壞，融合蛋白比 天然的外源蛋白更加穩(wěn)定, 缺點(diǎn)：需要去除原核多肽。 原核多肽切除方法：化學(xué)裂解法和酶解法。,(3) 分泌表達(dá) 優(yōu)點(diǎn)：防止大腸桿菌對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的降解，減輕

18、大腸 桿菌代謝負(fù)荷和恢復(fù)表達(dá)產(chǎn)物天然構(gòu)象。, 包涵體益處：防止蛋白酶對(duì)表達(dá)蛋白的降解，有利于表達(dá)產(chǎn)物分離純化。, 包涵體缺點(diǎn)：表達(dá)蛋白不具有生物活性，必須溶解包涵體并對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行復(fù)性。,2. 包涵體(inclusion body), 是大腸桿菌高效表達(dá)外源基因時(shí)形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白質(zhì)顆粒，在顯微鏡下觀察時(shí)為高折射區(qū)，與細(xì)胞質(zhì)中的其他成分有明顯的區(qū)別。,二、真核表達(dá)體系,1. 酵母表達(dá)體系 (1) 酵母表達(dá)體系具有諸多優(yōu)點(diǎn)：, 可以對(duì)蛋白進(jìn)行多種翻譯后修飾 培養(yǎng)簡(jiǎn)單 自身分泌蛋白少，是理想的分泌型表達(dá)系統(tǒng) 具有較高的安全性，如啤酒酵母表達(dá)體系 分離純化的過(guò)程比較簡(jiǎn)單,(2) 酵母表達(dá)體系實(shí)例 干擾素、人表皮生長(zhǎng)因子、人乙型肝炎表面抗原 和核心抗原等。,2. 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系 優(yōu)點(diǎn)： 可表達(dá)克隆的cDNA，也可表達(dá)真核基因組 DNA。 表達(dá)蛋白可被適當(dāng)修飾。, 缺點(diǎn)： 操作技術(shù)難 費(fèi)時(shí) 成本高,三、重組蛋白質(zhì)分析鑒定,重組蛋白質(zhì)的鑒定方法及標(biāo)準(zhǔn),四、重組蛋白質(zhì)藥物制備, 生物制藥領(lǐng)域的上游技術(shù)包括基因克隆、表達(dá)載體構(gòu)