蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測(cè)定.ppt

1、蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測(cè)定，主要內(nèi)容：(1)了解蛋白質(zhì)的兩性解離特性。(2)學(xué)習(xí)如何確定蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。蛋白質(zhì)的解離性，是兩性電解質(zhì)。蛋白質(zhì)溶液中存在以下平衡：蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)、蛋白質(zhì)分子的解離狀態(tài)和程度受溶液的酸堿度影響。當(dāng)溶液的酸堿度達(dá)到一定值時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒上的正電荷和負(fù)電荷數(shù)量相等。在電場(chǎng)中，蛋白質(zhì)既不移動(dòng)到陰極也不移動(dòng)到陽(yáng)極。此時(shí)，溶液的酸堿度被稱為這種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。不同的蛋白質(zhì)有其特定的等電點(diǎn)。在等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)的物理和化學(xué)性質(zhì)發(fā)生變化，這可以用來(lái)確定各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。最常用的方法是在溶液的溶解度最低時(shí)測(cè)量溶液的酸堿度。等電聚焦電泳用于測(cè)量?jī)綦姾蔀榱銜r(shí)的酸堿度濁度。分光光度法是基于蛋白質(zhì)和離

2、子交換的作用。首先，當(dāng)溶解度最低時(shí)，測(cè)量溶液的酸堿度。實(shí)驗(yàn)原理：通過(guò)觀察酪蛋白在不同酸堿度溶液中的溶解度，可以確定其等電點(diǎn)。用乙酸和檸檬酸鈉(乙酸鈉混合在酪蛋白溶液中)制備不同酸堿度的緩沖溶液。將酪蛋白加入緩沖溶液后，沉淀最多的緩沖溶液的酸堿度為酪蛋白的等電點(diǎn)。設(shè)備：水浴鍋、溫度計(jì)、200毫升錐形瓶、100毫升容量瓶、吸管、試管、試管架和研缽試劑：(1)0.4克酪蛋白醋酸鈉溶液(2)1.00摩爾l醋酸溶液(3)0.10摩爾l醋酸溶液(4)0.01摩爾l醋酸溶液、實(shí)驗(yàn)設(shè)備和試劑：(2)向上述試管中加入1毫升酪蛋白乙酸鈉溶液，加入一個(gè)試管并搖動(dòng)一個(gè)試管。此時(shí)，試管1、2、3和4的酸堿值依次為5.9

3、、5.3、4.7和3.5。觀察到混濁度。靜置10分鐘后，觀察濁度。最渾濁的試管的酸堿度是酪蛋白的等電點(diǎn)。等電聚焦電泳的原理：1)有一種兩性電解質(zhì)：它的等電點(diǎn)逐漸變化，差異很小，在電場(chǎng)作用下形成一個(gè)逐漸連續(xù)的酸堿度梯度，因此在電泳介質(zhì)中加入這種物質(zhì)可以使介質(zhì)的酸堿度由酸性逐漸變?yōu)閴A性。在電場(chǎng)的作用下，兩性電解質(zhì)載體根據(jù)其等電點(diǎn)從陽(yáng)極到陰極形成一個(gè)連續(xù)穩(wěn)定的酸堿度梯度。聚丙烯酰胺凝膠用作電泳支持介質(zhì)，兩性電解質(zhì)載體加入凝膠中。在電場(chǎng)的作用下，蛋白質(zhì)以這種酸堿度梯度在凝膠中游動(dòng)。當(dāng)它們遷移到pI值時(shí)，它們不再游泳，而是集中在狹窄的區(qū)域。第三章。實(shí)驗(yàn)試劑和儀器1)兩性電解質(zhì)2)30%丙烯酰胺溶液3)T

4、EMED 4)10%過(guò)硫酸銨溶液5)負(fù)緩沖液：0.1M氫氧化鈉正緩沖液：0.1M磷酸或硫酸固定液：10(重量比)三氯乙酸染色液脫色液蛋白質(zhì)等電點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)電泳槽，圖聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳示意圖(a為正面，b為橫截面)。四.操作方法1。凝膠柱的制備(1)將玻璃管的一端插入橡皮帽中(2)配置表10毫升7.5%凝膠制備試劑名稱體積(毫升)凝膠儲(chǔ)存溶液2.5兩性電解質(zhì)載體0.5蒸餾水6.75 10%過(guò)硫酸銨0.05 10%TEMED 0.1蛋白質(zhì)混合樣品0.1，然后在真空干燥器中抽吸10分鐘；(3)將制備好的凝膠溶液加入事先用細(xì)長(zhǎng)滴管準(zhǔn)備好的玻璃管中，直到它離開(kāi)上端1厘米，然后用注射器緩慢加水至3-5毫米的

5、高度。電泳將裝有凝膠的玻璃管固定在電泳槽上槽的孔中(安裝時(shí)，確保凝膠管垂直，橡膠塞孔密封)。在上罐中加入0.1摩爾/升氫氧化鈉溶液，在下罐中加入0.1摩爾/升磷酸鹽緩沖溶液。連接電泳儀，打開(kāi)電源，調(diào)節(jié)電壓至160伏，整夜聚焦，當(dāng)電流降至0時(shí)關(guān)閉電源。3、剝離電泳后，取下凝膠管，用蒸餾水清洗兩端的電極溶液，并標(biāo)記陽(yáng)性將裝有水的注射器的長(zhǎng)針插入凝膠和玻璃管壁之間，在壓水的同時(shí)慢慢旋轉(zhuǎn)玻璃管，向前推動(dòng)針，同時(shí)注射水。玻璃管的內(nèi)壁通過(guò)水壓和潤(rùn)滑力與凝膠分離，凝膠條可以流出。4.將凝膠條固定并染色，放在干凈的玻璃板上，用直尺測(cè)量固定前凝膠條的長(zhǎng)度。將其放入帶蓋的試管中，加入固定液。固定20分鐘后，倒出固定液，用脫色液沖洗兩次，染色1小時(shí)，用蒸餾水沖洗幾次，用脫色液脫色，直至蛋白帶清晰，并測(cè)量蛋白帶與正極端之間的距離。5.蛋白質(zhì)帶聚焦位置的計(jì)算蛋白質(zhì)帶聚焦位置和凝膠帶正端之間的實(shí)際長(zhǎng)度如下：蛋白質(zhì)帶中心和凝膠帶正端之間的距離在染色前和染色后是固定的；3.濁度和分光光度法，當(dāng)溶液的酸堿度與蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)相同時(shí)，靜電荷為0；當(dāng)溶液的酸堿度大于蛋白質(zhì)的等