微生物生態(tài)學-10-1污染環(huán)境的微生物修復技術.ppt

1、污染環(huán)境的微生物修復技術,蔣建東 E-MAIL：jiang_,環(huán)境的化學污染,化學曾經為社會的進步發(fā)現(xiàn)了或合成了成千上萬種新的化合物，到了1985年，在美國化學文摘（Chemical Abstracts, CA）上正式登錄的化合物數(shù)目已達到了600萬種，1990年就超過了1000萬種，目前已知的化合物遠遠超過3000萬種！ 全球人工合成的化學物質，1970年已達6000多萬噸，到1985年增加到2億5千萬噸。 大量的環(huán)境異生物質通過各種途徑進入環(huán)境，含量不一，變化多端，對環(huán)境帶來巨大影響，給地球生物帶來各種即時的或潛在的危害。,進入自然界中的化合物（污染物）受到物理、化學、光化學和生物的作用而

2、降解轉化。 研究證明，生物作用是物質降解的主要機制，而微生物又在其中占重要地位。,微生物具有強大的降解轉化能力,微生物種類繁多，分布廣，代謝類型多樣 微生物個體微小，比表面積大，代謝速率快 微生物繁殖快，易變異，適應性強 具有多種降解酶 微生物的降解性質粒對環(huán)境異生物質的降解,天然降解性質粒,微生物對污染物降解機制,礦化作用（mineralization） 指有機物在微生物的作用下徹底分解為H2O、CO2和簡單的無機化合物的過程，是徹底的生物降解（終極降解)，可從根本上清除有毒物質的環(huán)境污染。實質都是酶促反應。 共代謝作用（Co-metabolism） 當環(huán)境中存在其他可利用的碳源和能源時，難

3、降解的化合物才能被利用（被修飾或轉化但非徹底降解）。,生物降解與生物催化數(shù)據(jù)庫 共收集了 1147 種化合物； 178 條代謝途徑； 1236 種反應； 802 種酶； 共涉及467 種微生物 總結了252 條生物降解與轉化的規(guī)律,Dehalococcoides ethenogenes, 清除有機溶劑造成的污染；,Pseudomonas putida KT2440, 有機污染物的生物修復中潛力巨大，該菌株甚至還能促進植物生長并具有抗植物病害作用；,Alcanivoraxborkumensis, 海洋石油消除。,Caulobacter crescentus, 應用于低營養(yǎng)水環(huán)境的生物修復；,完成

4、全基因組測序的環(huán)境修復修復相關,Geobacter sulfurreducens, 幫助轉化鈾和其它一些放射性金屬物質,Desulfovibrio vulgaris, 幫助修復鈾和鉻等重金屬污染；,Shewanella oneidensis 去除鉻、鈾等環(huán)境有毒金屬；,Deinococcus radiodurans，地球上最耐輻射的的生物，耐受的輻射劑量150萬拉德，是人類耐受1000-3000倍；,微生物修復技術,是指利用處理系統(tǒng)中的微生物的代謝活動來減少污染現(xiàn)場污染物的濃度，或者使環(huán)境中的污染物的危害減少到最低程度。 這種技術的最大特點是可以對大面積的污染環(huán)境進行治理，目前所處理的對象主要

5、有石油、廢水及農藥污染。,微生物修復的產業(yè)化水平 國外尤其是美國許多生物修復公司，針對土壤污染物種類，研制了相應的微生物制劑、營養(yǎng)添加劑和配套的工藝措施，開展了土壤中化學農藥、石油烴、重金屬等污染的微生物治理。 美國BCI公司（Bioremediation Consulting Inc.） 美國WIK Associates Inc美國工程服務生物修復公司（Engineering Services and Bioremediation Company）。,美國WIK Associate Inc. 開發(fā)的Bugs+plus系列環(huán)境修復用生物制劑產品,石油污染的微生物降解與修復,石油是含有多種烴類（

6、正烷烴、支鏈烷烴、芳烴、環(huán)烴）及少量其他有機物（硫化物、氮化物、酸類）的復雜混合物。,石油廢水中常見的有毒烴類有機化合物,石油廢水中常見的有毒的含氮、含硫有機化合物,目前環(huán)境中烴類化合物污染的主要來源是石油污染，石油開采、運輸、加工、使用過程均可對環(huán)境造成污染；油輪失事、油田漏油、噴井等使大面積海域或土地受嚴重的污染。,2003年，載有7.7萬噸燃料油的“威望號”油輪13日在西班牙加利西亞省海域擱淺，船體破裂，有5000噸料油泄漏，形成一條巨大的污染帶。 原油在強風大浪的作用下，已經蔓延到加利西亞海岸。,船體側翻,正在下沉,沉沒瞬間,平靜下的不安,海底“定時炸彈”,“威望”號油輪上共載有7萬多

7、噸原油，目前，泄漏的原油總數(shù)已猛增至5000 噸，對西班牙境內腓尼斯特雷角和馬爾皮卡間33.6 公里的海域造成嚴重污染。 在污染最嚴重的海域，泄漏的原油有38.1厘米深，一眼看去海面上一片黑。 由于數(shù)十萬鳥類都在事發(fā)海域過冬，原油的泄漏將會對當?shù)氐纳鷳B(tài)環(huán)境造成毀滅性打擊，一些珍貴物種從此不復存在。,海洋表面的石油經擴散、揮發(fā)、乳化、沉淀后，部分可能受紫外線作用而發(fā)生光分解，但速度很慢。 石油降解微生物廣泛分布于自然界。微生物可在12周內形成細菌群落，23月內石油被分解消失。石油降解微生物目前已知有100余屬，200多種，分屬于細菌、放線菌、霉菌、酵母和藻類。,石油降解微生物 細菌：假單胞菌屬(

8、G-)、黃桿菌屬、棒桿菌屬、無色桿菌屬、不動桿菌屬、小球菌屬、弧菌屬、藍細菌等 放線菌：洛卡氏菌屬和分支桿菌屬，但對烴類降解不徹底，有中間產物積累。 真菌：有枝孢霉、曲霉、青霉等屬的菌株；酵母有假絲酵母屬（Candida），紅酵母屬、球擬酵母屬中的菌。,石油生物降解機理： （1）烷烴的分解過程是逐步氧化，微生物攻擊鏈烷的末端（次末端）甲基，由加氧酶催化生成相應的醇、醛（酮）和酸（酯），而后經-氧化，形成短鏈脂肪酸和乙酰CoA進入三羧酸循環(huán)。,環(huán)烷烴降解途徑,芳香烴化合物好氧代謝途徑,芳香烴被微生物降解時，如有側鏈，一般先從側鏈開始氧化。然后發(fā)生芳香環(huán)的氧化：由加氧酶氧化為鄰苯二酚（兒茶酚），二

9、羥基化的芳香環(huán)再氧化，鄰位或間位開環(huán)（如苯）。 多環(huán)芳烴的生物降解，現(xiàn)先是一個環(huán)二羥基化、開環(huán)，然后第二個環(huán)以同樣的方式降解。,咔唑 (Carbozole，簡稱CA)的代謝,由于大部分咔唑類、噻吩類雜環(huán)化合物的化學鍵相當牢固，在常溫常壓下，化學法幾乎不可能降解石油中有機硫、有機氮及其它難以降解的雜環(huán)化合物。,含原油廢水的處理效果,化石燃料煤和石油的微生物脫硫技術,化石燃料煤和石油中所含有的有機硫和無機硫是環(huán)境的重要污染源,嚴重性 1998年我國有一半以上城市降水pH低于5.6。華中地區(qū)酸雨出現(xiàn)頻率大于70%，降水的年均pH低于5.0，酸雨面積占國土面積的30%，是繼歐洲、北美后世界第三大中酸雨

10、區(qū)。 迫切性 隨著能源危機的逐步加劇，開采高硫化石燃料成為必然。高硫化石燃料必須預先經過脫硫處理才能進一步使用。,煤炭的化學結構模型,石油大分子的放大結構圖,有機硫類型,有機硫化物包括硫醇、硫化物及含硫的雜環(huán)化合物，共分為13類，包括176種不同結構，其中噻吩含量最多。,煉油過程中物理和化學的除硫成本大,原油中大多數(shù)的H2S是在油井現(xiàn)場的油氣分離過程中除去的。 在煉油廠采用催化裂解和加氫脫硫(HDS)過程，加熱到350C后蒸餾除去結合硫，但這些技術需高溫、高壓，且能耗大。 目前相當多的資金用于石油的物理化學法脫硫上，1993年全世界用于HDS過程的資金達250億美元。 到下個世紀，隨著需求的增

11、加和低硫原油的耗盡，高硫原油將不斷增加，因此石油脫硫成為必然。,生物脫有機硫的優(yōu)勢,BDS在常溫常壓下操作，而且能耗比HDS低70-80%。 該過程還可回收有機磺酸鹽等高值化學品，可為煉油廠增加經濟效益。采用BDS技術的投資額約為加氫脫硫技術(HDS)的一半，操作費用比HDS低10%-25%。 據(jù)報道，采用BDS可使FCC汽油的硫含量從1400ppm降至150ppm(以滿足整個汽油組分平均硫質量含量為50ppm的要求)。 從整個汽油組分來講，煉油廠每m3成品汽油的BDS成本1.59-2.65US$，低于HDS成本。,FCC汽油中硫化合物的分布及煉制油品要求,微生物脫硫的途徑,以二苯并噻吩為模式

12、化合物的脫硫途徑 以苯并噻吩為模式化合物的脫硫途徑 以噻吩為模式化合物的脫硫途徑,二苯噻吩(Dibenzothiophene,簡稱DBT)被作為一個脫有機硫模式化合物來研究,在高餾分油中，超過60%的硫是以二苯噻吩及其衍生物的形式存在的，因此實驗室一般使用DBT作為生物脫硫研究的模式化合物。,生物脫有機硫代謝途徑類型,碳架破壞途徑(C-C鍵被切斷) 碳架保留途徑(專一地切斷C-S鍵而保留完整的碳架),(1) 碳架破壞途徑(C-C鍵被切斷),(1)碳架保留途徑(專一地切斷C-S而保留完整的碳架),苯并噻吩（Benzothiophene，BTH）脫硫代謝途徑,FCC汽油中主要的含硫有機化合物包括B

13、TH及其衍生物，其中BTH占30%。 Finnerty et al.（1983）報道了幾株可以利用BTH為專一硫源和碳源進行生長的菌株，不過由于其損失燃料熱值而沒有應用價值。 近幾年發(fā)現(xiàn)能夠了專一性降解BTH菌株，主要包括戈登氏菌株、類芽孢桿菌、中華根瘤菌以及紅球菌。,微生物脫有機硫BTH降解途徑,A是BTH B是BTH sulfoxide C，D是BTH sulfone F是benzoe1,2oxathiin S-xoide E是o-hydroxystyrene G是2-(2-hydroxyphenyl) ethan-1-al 微生物包括： 戈登氏菌株（Gordonia sp.）213E 類

14、芽孢桿菌（Paenibacillus sp.）A11-2 紅球菌（Rhodococcus sp.）T09 中華根瘤菌（Sinorhizobium sp.）KT55 紅球菌KT462,噻吩（Thiophene）代謝,噻吩代表了最簡單的雜環(huán)含硫化合物。 生物處理方法，一般都會導致噻吩的降解，而得到開環(huán)的化合物。 至今還沒有報道通過硫專一途徑脫除噻吩中硫的菌株。,其它含硫化合物的代謝,硫醇和烷烴化的硫醇。 菌株為排硫硫桿菌（Thiobacillus thioparus），可以通過甲基硫醇氧化酶作用，氧化硫醇定量生成甲醛，S0和過氧化氫。,處理柴油（535 ppm）含硫化合物檢測,X7B休止細胞作用于

15、柴油后，GC-AED檢測含硫化合物變化,535 ppm,72 ppm,柴油（ 535 ppm ）中烷烴變化情況,GC-FID檢測柴油經過生物催化劑處理前后烷烴變化， 圖中顯示烷烴為C12-C25。,汽油脫硫前后含硫有機化合物的變化,汽油脫硫前后烴類物質變化情況,脫前,脫后,農藥的微生物降解與修復技術,農藥作為農業(yè)豐收的重要保障，在世界各地范圍內廣泛使用,世界各地的農藥使用情況,(2002 數(shù)據(jù)) 世界年使用量為140萬噸（純品） 北美占30.3% (美國28% ) 歐洲占22.7% 亞洲占25.8% 南美占12.3% 其它占9% 全球市場達277 億美元; 除草劑占48% 殺蟲劑占28% 殺真

16、菌劑占19% 其它占5%,世界上超過1億公頃的土壤受到污染 美國3.2千萬公頃 歐盟超過1億處地方受污染 其中 3萬處急需處理，超過10億m3的土壤 European Topic Centre Soil, 1998,世界各地的土壤污染問題,農藥的污染現(xiàn)狀,除草劑的藥害問題,磺酰脲類除草劑在土壤中降解緩慢，殘效期長，土壤中的累積殘留往往對下茬作物產生藥害。2005年內蒙古呼倫貝爾市1300萬畝大豆田因除草劑藥害減產30%；黑龍江省5000萬畝大豆田因除草劑藥害，減產25億公斤。,降解農藥的微生物種類,對硫磷、甲基對硫磷降解途徑,假單胞菌屬和枯草芽孢桿菌等都能通過硝基還原作用或磷酯鍵上酶促水解作用

17、，最終產物可能生成CO2 和NO2-。,均三氮苯類除草劑,S-阿特拉律降解的一般過程 （引自C Yanze-Kontchou 和 N Gschwind,1994）,三聚氰胺(Melamine),除草劑2,4-D,，的降解途徑 （引自Walter Mulbry 和 Philip C.Kearney,1991）,HCH在Sphingobium japonicum UT26中的代謝途徑 1，HCH；2，-五氯環(huán)己烯（-PCCH）；3，1,3,4,6-四氯-1,4-環(huán)己二烯(1,4-TCDN)；4，1,2,4-三氯苯(1,2,4-TCB)；5，2,4,5-三氯-2,5-環(huán)己二烯-1-醇(2,4,5-D

18、NOL)；6，2,5-二氯苯酚(2,5-DCP)；7，2,5-二氯-2,5-環(huán)己二烯-1,4-二醇(2,5-DDOL)；8，2,5-二氯對苯二酚（2,5-DCHQ）；9，氯代對苯二酚（CHQ）；10，對苯二酚（HQ）；11，酰氯；12，-羥基己二烯二酸半醛(-HMSA)；13，順丁烯乙酸；14，-酮己二酸,-HCH的降解途徑（ -HCH）,Keisuke M詳細研究了UT26對-HCH的降解途徑。 -HCH的降解途徑分為上游和下游途徑。 首先-HCH 連續(xù)脫去兩分子HCl經歷五氯環(huán)己烯（PCCH）后生成 1,3,4,6-四氯-1,4-環(huán)己二烯(1,4-TCDN)。 再連續(xù)經歷兩步水解脫氯反應后

19、生成 2,5-二氯-2,5-環(huán)己二烯-1,4-二醇（2,5-DDOL）。再被脫氫生成2,5-二氯對苯二酚（2,5-DCHQ）。 下游途徑中2,5-DCHQ被進一步的降解為氯代對苯二酚（CHQ）、（對苯二酚）HQ直至CO2和H2O。,農藥微生物降解的代謝途徑與降解基因,農藥污染土壤的微生物修復研究,一方面在許多研究中，通過添加營養(yǎng)元素等外在條件刺激土著降解性微生物的作用來達到修復效果。 Fulthorpe（1996）等從巴基斯坦土壤中分離的微生物都能礦化2,4-D，并發(fā)現(xiàn)添加硝酸鹽、鉀離子和磷酸鹽能增加降解率。加拿大的Stauffer Management 公司數(shù)年來發(fā)展了一些農藥污染土壤的生物

20、修復技術，他們在特定環(huán)境中通過激發(fā)降解性土著微生物群落的功能達到修復目的，并且在美國專利局獲得了3項專利。,另一方面，許多研究證實了通過接種外源降解性微生物可以達到很好的生物修復效果。 Nassser從污染了氯乙異丙嗪的土壤中分離到混和微生物培養(yǎng)物，接種到土壤中可將0.14mM的氯乙異丙嗪在25d內完全降解，使其礦化速度提高了20倍。 Shapir等人報道，在受除草劑阿特拉津污染的土壤中投加Pseudomonas sp. ADP進行生物強化，可使阿特拉津達到90-100%的降解。Struthers等分離到A. radiobacter J14a，并將其接種到只具有少量野生降解菌的阿特拉津的土壤中

21、，發(fā)現(xiàn)阿特拉津的礦化速度提高了2-5倍；而將其接種到含大量阿特拉津降解菌的土壤中則縮短了降解的延滯時間。,農藥污染土壤微生物修復的小規(guī)模田間試驗,南京農業(yè)大學農藥殘留微生物修復技術的研究進展,高效降解菌株篩選與菌種庫的建立,利用微生物分離篩選技術，從環(huán)境中獲得有研究意義或實用價值的微生物資源一直是研究重點。 目前分離篩選到農藥和有毒有機污染物降解的微生物菌種資源500株以上，農藥降解效率國際領先的菌株30余株，建立了種類齊全的我國最大的農藥降解菌種庫，能降解的農藥有有機磷、有機氮、有機氯、菊酯類、氨基甲酸酯、磺酰脲類等農藥。,2 h內完全礦化5mg/L的、四種六六六異構體。 國際報道的S. p

22、aucimobilis UT26只能降解 和 兩種異構體，完全礦化 需要4h，20h才能降解12.6%的異構體。,六六六降解菌BHC-A（Sphingomonas sp.）,部分高效菌株介紹,DDT降解菌株 DB-1 （Sphingomonas sp.）,菌株DB-1的電鏡照片,DDT降解的紫外掃描圖譜,10d中對DDT的降解率在75.7-83.6%之間。而國外報道的菌株（Cladosporium sp.）要達到相同的降解率的時間長達30d。,呋喃丹農藥降解菌CDS-1（Sphingomonas agerus ）,24h內礦化100 mg/kg的呋喃丹, 國際報道的同類菌株需15d。,阿特拉津

23、降解菌ADP-1（Micrococcus sp.）,24 h內完全礦化100 mg/kg的阿特拉津,24h內完全礦化500mg/kg的甲基對硫磷，效果穩(wěn)定，降解譜廣，能降解對硫磷、辛硫磷、馬拉硫磷、敵敵畏、樂斯本等有機磷農藥。,甲基對硫磷降解菌DLL-1（Pseudomonas putida）,三唑磷降解菌mp-4（Ochrobactrum sp.）,國際首次報道能降解三唑磷的高效菌株，大田水稻上的三唑磷農藥降解效果90%以上。,菊酯類農藥降解菌,甲氰菊酯富集液 92.15%,甲氰菊酯CK,甲氰菊酯處理,氯菊酯富集液 99.28%,氯菊酯CK,氯菊酯處理,氰戊菊酯富集液 55%,氰戊菊酯CK,

24、氰戊菊酯處理,溴氰菊酯富集液 89.10%,溴氰菊酯CK,溴氰菊酯 處理,培養(yǎng)36hr完全降解100ppm的多菌靈農藥,多菌靈農藥降解菌,殺螟硫磷降解菌株FDS-1,FDS-1對殺螟硫磷的降解,甲拌磷降解菌株M-1,DSP-1對毒死蜱的降解,毒死蜱降解菌DSP-1,M-1對甲拌磷的降解,處理（農藥+降解菌）,對照（農藥）,發(fā)現(xiàn)使用六六六降解菌可以在15d內將30 mg/kg 的、四種六六六異構體降解低到0.33 mg/kg,降解菌株的盆缽試驗,發(fā)現(xiàn)使用阿特拉津降解菌可以明顯解除阿特拉津除草劑對小麥生長的抑制,降解菌劑在土壤中降解農藥的動態(tài),結論：降解菌劑能有效降解農藥并最終消亡，不會成為優(yōu)勢菌

25、群，不會影響土壤環(huán)境的生態(tài)安全,結論：降解菌劑的使用能恢復因農藥使用而造成的土壤微生物多樣性的減少,降解菌劑應用對土壤微生物多樣性的影響,降解菌劑使用對作物的影響,結論：降解菌劑的使用對小麥株高、根長和鮮重等沒有不良影響,平板培養(yǎng)法檢測土壤中GFP基因標記的降解菌菌落 A：未接種 B：接種,A,B,GFP基因標記的降解菌菌落發(fā)熒光,土著微生物菌落無熒光,菌劑跟蹤與定殖,綠色熒光蛋白（GFP）基因標記的降解菌在植株根內的激光共聚焦掃描,綠色熒光蛋白（GFP）基因標記的降解菌在土壤中的激光共聚焦掃描,綠色熒光蛋白（GFP）基因標記菌株的激光共聚焦掃描結果表明，降解菌能在土壤和植株中定殖,新的甲基對硫磷水解酶基因mpd,從甲基對硫磷降解菌M6中克隆到一個新的甲基對硫磷水解酶基因mpd(AF338729)； 從三唑磷降解菌mp-4中克隆到一個三唑磷水解酶tpd基因（AY627036）。,農藥降解關鍵酶基因的克?。?8個降解基因）,還從BATH1(Arthrobacte sp.)中克隆到atzA、atzB和atzC基因； 六六六降解菌BHC-A中克隆到linA、linB、linC、linD、linE、l