非無菌產(chǎn)品微生物檢查控制菌檢查法ppt課件

1、非無菌產(chǎn)品微生物檢查：控制菌檢查法,1,PPT學(xué)習(xí)交流,概述,控制菌檢查法系用于在規(guī)定的試驗(yàn)條件下，檢查供試品中是否存在特定的微生物。 當(dāng)本法用于檢查非無菌制劑及其原、輔料是否符合相應(yīng)的微生物標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，應(yīng)按規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)，包括樣品取樣量和結(jié)果判斷等。 本檢查法可采用替代的微生物檢查法，包括自動檢測方法， 但必須證明替代方法等效于藥典規(guī)定的檢查方法。,2,PPT學(xué)習(xí)交流,概述,微生物限度檢查法中的控制菌檢查在藥典一、二、三部附錄中內(nèi)容基本一致 參照ICH協(xié)調(diào)案”非無菌藥品微生物限度檢查：控制菌檢查”進(jìn)行修訂。 主要修訂內(nèi)容 控制菌檢查項(xiàng)目、培養(yǎng)基體系、 培養(yǎng)基適用性檢查、 檢查方法適用性試驗(yàn)、 結(jié)果

2、判斷等。,3,PPT學(xué)習(xí)交流,供試液制備及實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求 -同非無菌產(chǎn)品微生物檢查：微生物計(jì)數(shù)法。 -如果供試品具有抗菌活性，應(yīng)盡可能去除或中和。 -中和劑或滅活劑的使用 使用了中和劑或滅活劑應(yīng)確認(rèn)有效性及對微生物的無毒 性并應(yīng)確認(rèn)供試液 與所使用的中和劑或滅活劑的相容性。,控制菌檢查法,4,PPT學(xué)習(xí)交流,增修訂內(nèi)容,收載方式 檢驗(yàn)項(xiàng)目 替代法的應(yīng)用原則 結(jié)果判斷方式,5,PPT學(xué)習(xí)交流,收載方式,6,PPT學(xué)習(xí)交流,檢驗(yàn)項(xiàng)目,7,PPT學(xué)習(xí)交流,替代法的應(yīng)用原則,本檢查法可采用替代的微生物檢查法，包括自動檢測方法，但必須證明替代方法等效于藥典規(guī)定的檢查方法。,8,PPT學(xué)習(xí)交流,收載方式及結(jié)

3、果判斷方式,9,PPT學(xué)習(xí)交流,修訂內(nèi)容 控制菌檢查用培養(yǎng)基數(shù)量減少7個(gè)；在增菌過程，使用無選擇性增菌培養(yǎng) 基培養(yǎng) 理由 污染菌受到環(huán)境、加工過程及儲存等影響，受到損傷，使用無選擇性增 菌培養(yǎng)基培養(yǎng)，使受損傷的細(xì)菌得到修復(fù)，提高檢出率。,培養(yǎng)基適用性試驗(yàn),10,PPT學(xué)習(xí)交流,培養(yǎng)基是絕大多數(shù)微生物試驗(yàn)的基礎(chǔ)其質(zhì)量是微生物試驗(yàn)成功關(guān)鍵因素。 適宜的培養(yǎng)基制備方法、貯藏條件和質(zhì)量控制試驗(yàn)是提供優(yōu)質(zhì)培養(yǎng)基的保 證。,培養(yǎng)基適用性試驗(yàn),11,PPT學(xué)習(xí)交流,培養(yǎng)基的配制 可按處方制備也可使用按處方生產(chǎn)的符合規(guī)定的商品化成品培養(yǎng)基，脫水培養(yǎng)基除附有處方和使用說明外還應(yīng)注明有效期、貯存條件、適用性試驗(yàn)的

4、質(zhì)控菌株和用途。配制時(shí)應(yīng)按使用說明上的要求操作，受潮結(jié)塊不能使用，確保培養(yǎng)基的質(zhì)量符合要求。,培養(yǎng)基適用性試驗(yàn),12,PPT學(xué)習(xí)交流,再驗(yàn)證 如果其中有任一控制點(diǎn)發(fā)生變化,應(yīng)重新進(jìn)行培養(yǎng)基適用性檢查。 當(dāng)檢驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)異?；?qū)嶒?yàn)室質(zhì)量控制需要，也可通過培養(yǎng)基適 用性檢查提供一定依據(jù)。,培養(yǎng)基適用性檢查試驗(yàn),13,PPT學(xué)習(xí)交流,固體培養(yǎng)基或原料變質(zhì)不應(yīng)使用；配制培養(yǎng)基儲存過程中發(fā)現(xiàn) 渾濁、變色、 有菌生長、嚴(yán)重脫水等變化不應(yīng)再使用。 不同處方培養(yǎng)基的替代使用不能通過培養(yǎng)基適用性試驗(yàn)確定。 除特殊規(guī)定外，培養(yǎng)基配制采用蒸餾水或純化水，但應(yīng)進(jìn)行檢測控制，如蒸 餾水pH值應(yīng)為57。 盡量臨用現(xiàn)配。,培

5、養(yǎng)基適用性檢查,14,PPT學(xué)習(xí)交流,配制培養(yǎng)基的保存 培養(yǎng)基滅菌后，不得在高壓鍋內(nèi)過夜； 固體培養(yǎng)基滅菌或融化后，放置不得超過8h； 培養(yǎng)基于225 保存，但不應(yīng)超過21 d； 固體瓊脂培養(yǎng)基 熔化再使用應(yīng)不超過1次。,培養(yǎng)基適用性檢查,15,PPT學(xué)習(xí)交流,菌種來源 國內(nèi)外認(rèn)可的菌種保藏中心。 試驗(yàn)用菌株的傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保藏中心 獲得的干燥菌種為第0 代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保存，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性 金黃色葡萄球菌 CMCC（B）26 003 銅綠假單胞菌 CMCC（B）10 104 大腸埃希菌 CMCC（B）44 102 乙型副傷寒沙門菌 CMCC（B）5

6、0 094 白色念珠菌 CMCC（F）98 001 生孢梭菌 CMCC（B）64 941,菌種及菌液制備,16,PPT學(xué)習(xí)交流,菌液制備,金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、沙門菌 胰酪大豆胨肉湯或在胰酪大豆胨瓊脂3035，1824h 白色念珠菌 沙氏葡萄糖瓊脂或沙氏葡萄糖肉湯2025， 23天 生孢梭菌梭菌增菌培養(yǎng)基3035，置厭氧條件下培養(yǎng)2448小時(shí),17,PPT學(xué)習(xí)交流,菌懸液的制備 稀釋劑 pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成適宜濃度的菌懸液。 菌懸液的貯存 若在室溫下放置，應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用； 若保存在28，可在24小時(shí)內(nèi)使用。 生孢梭菌孢子懸液可替代新鮮的菌懸液，穩(wěn)定的孢子

7、懸液可保 存在28，在驗(yàn)證過的貯存期內(nèi)使用。,菌液制備,18,PPT學(xué)習(xí)交流,陰性對照試驗(yàn),確認(rèn)試驗(yàn)條件是否符合要求。 稀釋劑代替供試品進(jìn)行陰性對照試驗(yàn)，陰性對照試驗(yàn)應(yīng)無菌生長。 供試品檢查時(shí)也需進(jìn)行陰性對照試驗(yàn)。如果陰性對照有菌生長，應(yīng) 進(jìn)行偏差調(diào)查。,19,PPT學(xué)習(xí)交流,培養(yǎng)基適用性檢查,成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基 的適用性檢查。 促生長能力、抑制能力及指示特性的檢查。 菌株見表,20,PPT學(xué)習(xí)交流,培養(yǎng)基適用性檢查,21,PPT學(xué)習(xí)交流,培養(yǎng)基適用性檢查,22,PPT學(xué)習(xí)交流,培養(yǎng)基適用性檢查,液體培養(yǎng)基促生長能力檢查 接種不大于100cfu的試驗(yàn)菌在

8、不長于規(guī)定的最短培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)，被檢培養(yǎng)基管試驗(yàn)菌應(yīng)生長良好。 固體培養(yǎng)基促生長能力 接種取菌懸液0.1ml），涂布于培養(yǎng)基平板上，在規(guī)定的溫度及時(shí)間下培養(yǎng) 。 不長于規(guī)定的最短培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)。被檢培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基上生長的菌落大小、形 態(tài)特征應(yīng)一致。,23,PPT學(xué)習(xí)交流,培養(yǎng)基適用性檢查,培養(yǎng)基抑制能力檢查 接種不少于100cfu的試驗(yàn)菌于被檢培養(yǎng)基。不短于規(guī)定的最長培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)。 試驗(yàn)菌應(yīng)不得 生長。 培養(yǎng)基指示特性檢查 取試驗(yàn)菌懸液各0.1ml涂布于培養(yǎng)基平板上在不長于規(guī)定的最短時(shí)間下培養(yǎng)， 被檢培養(yǎng)基上試 驗(yàn)菌生長的菌落大小、形態(tài)特征、指示劑反應(yīng)情況等應(yīng)與對照培養(yǎng)基一致。,24,P

9、PT學(xué)習(xí)交流,方法適用性試驗(yàn)試驗(yàn)菌,25,PPT學(xué)習(xí)交流,方法適用性試驗(yàn),26,PPT學(xué)習(xí)交流,方法適用性試驗(yàn)結(jié)果判斷,27,PPT學(xué)習(xí)交流,供試品檢查,供試品的控制菌檢查應(yīng)按已驗(yàn)證的方法進(jìn)行。 陽性對照試驗(yàn) 試驗(yàn)方法 同供試品的控制菌，加菌量應(yīng)不大于100cfu。應(yīng)檢出相應(yīng)的控制菌。,28,PPT學(xué)習(xí)交流,供試品檢查耐膽鹽革蘭陰性菌,耐膽鹽革蘭陰性菌取代2010年版大腸菌群檢查 大腸菌群的定義 是指在37生長時(shí)能發(fā)酵乳糖，24h內(nèi)產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭陰性、氧化酶陰性、需氧或兼性厭氧的無芽孢桿菌。 符合上述定義的菌除埃希菌屬外，還包括腸桿菌科的腸桿菌屬、枸櫞酸菌屬、克雷伯菌屬。,29,PPT學(xué)習(xí)交流

10、,耐膽鹽革蘭陰性菌檢查,檢驗(yàn)程序 供試液制備 同“非無菌產(chǎn)品微生物檢查：微生物計(jì)數(shù)法制成1：10供試液，混勻。 預(yù)培養(yǎng) 在2025培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間一般2小時(shí),使供試品中的細(xì)菌充分恢復(fù)但不增殖。 未檢出試驗(yàn) 取相當(dāng)于1g或1mL供試品的上述預(yù)培養(yǎng)物接種至 腸道菌增菌肉湯中。 3035，培養(yǎng)2448小時(shí)。 劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上，置 3035，培養(yǎng)1824小時(shí)。 平板上無菌落生長，判供試品未檢出耐膽鹽革蘭陰性,30,PPT學(xué)習(xí)交流,耐膽鹽革蘭陰性菌檢查,定量試驗(yàn) 1、取定量供試品的預(yù)培養(yǎng)物或其稀釋液分別接種至腸道菌 增菌肉湯中。 3035，培養(yǎng)2448小時(shí)。 2、上述每一培養(yǎng)物分別劃線接

11、種于紫紅膽鹽葡萄 糖瓊脂平板上。 3035，培養(yǎng)1824小時(shí)。 若紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上有菌落生長，則對應(yīng)培養(yǎng)管為陽性，否則為陰 性。根據(jù)各培養(yǎng)管檢查結(jié)果，從表2查對1g或1ml供試品中含有耐膽鹽革蘭陰 性菌的最大可能數(shù)。,31,PPT學(xué)習(xí)交流,表2 耐膽鹽革蘭陰性菌的可能菌數(shù),32,PPT學(xué)習(xí)交流,供試品檢查大腸埃希菌,大腸埃希菌是腸桿菌科埃希菌屬的代表種。 大腸埃希菌是兩端鈍圓的短小直桿菌，（1.11.5）m(2.0 6.0)m單個(gè)或成 對，革蘭陰性無芽孢，多有鞭毛培養(yǎng)最適溫度為37可在15-46生長，兼性厭氧。,33,PPT學(xué)習(xí)交流,方法適用性試驗(yàn),34,PPT學(xué)習(xí)交流,大腸埃希菌檢查

12、,檢驗(yàn)程序 取供試品，照附錄“微生物計(jì)數(shù)法”制成1：10供試液。 取相當(dāng)于1g或1mL供試品的供試液，接種至適宜體積 的胰酪大豆胨肉湯中。 3035培養(yǎng)1824小時(shí)。 取上述預(yù)培養(yǎng)物1mL接種至100mL麥康凱肉湯中。 4244培養(yǎng)2448小時(shí)。 取麥康凱肉湯培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂平 板上。3035培養(yǎng)1872小時(shí)。結(jié)果判斷 -若麥康凱瓊脂平板上有菌落生長，應(yīng)進(jìn)行分離、純化及適宜的鑒定試 驗(yàn), 確證是否為大腸埃希菌； -若麥康凱瓊脂平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結(jié) 果為陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌。,35,PPT學(xué)習(xí)交流,供試品檢查 沙門菌,沙門菌為革蘭陰性桿菌，無芽孢，菌體

13、通常（0.40.9）m(13) m，兩 端鈍圓。需氧或兼性厭氧，1042皆可 生長，最適溫度37。,36,PPT學(xué)習(xí)交流,沙門菌檢查,37,PPT學(xué)習(xí)交流,沙門菌檢查,沙門菌在木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂平板上生長良好，菌落為 紅色、中心有或無黑色。 鑒定試驗(yàn) 挑選疑似菌落穿刺接種于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層 斜面上培養(yǎng) 1824小時(shí)，或采用其它適宜方法進(jìn)一步鑒定。 結(jié)果判斷 若木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂平板上有疑似菌落生長， 三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基 斜面為紅色、底層為黃色 或斜面黃色、底層有黑色 應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行適宜的鑒定試驗(yàn), 確證是否為沙門菌。 如果平板上沒有菌落生長, 或雖有菌落生長但鑒定結(jié)果為陰性 三糖鐵

14、瓊脂培養(yǎng)基 斜面未見紅色、底層未見黃色 或斜面黃色、 底層無黑色 判供試品未檢出沙門菌。,38,PPT學(xué)習(xí)交流,銅綠假單胞菌,形態(tài)特征 銅綠假單胞菌為革蘭陰性、直或微彎曲的桿菌，其菌體的長短不一，短的為球桿狀，長為絲狀，大?。?.51.0）m(1.53.0)m。 除在硝酸鹽培養(yǎng)基中以外都是專性好氧。 最適生長溫度為35，在42能生長，4不生長。,39,PPT學(xué)習(xí)交流,銅綠假單胞菌檢查,40,PPT學(xué)習(xí)交流,銅綠假單胞菌檢查,檢驗(yàn)程序 供試液制備 取供試品，照附錄“微生物計(jì)數(shù)法” 制成1：10 供試液。 取相當(dāng)于1g或1mL供試品的供試液，接種至適宜體積的胰酪 大豆胨肉湯中3035培養(yǎng)1824小

15、時(shí)。 接種 取上述預(yù)培養(yǎng)物劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂平 板上。 3035培養(yǎng)1872小時(shí)。 鑒定試驗(yàn) 取上述平板上生長的菌落進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)，或采用其它適宜方法進(jìn)一步鑒定。 確證試驗(yàn) 平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結(jié)果為陰性，或氧化酶試驗(yàn)陰性，判供試品未檢出銅綠假單胞菌。,41,PPT學(xué)習(xí)交流,金黃色葡萄球菌,形態(tài)特征 金黃色葡萄球菌屬于微球菌科葡萄球菌屬。 菌體呈球形或略呈橢圓形，菌體較小，直徑0.5-1.5m，平均直徑金黃色葡萄球菌對生長的營養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上生長良好，需氧或兼性厭氧，最適生長溫度為37，最適生長pH為7.4。,42,PPT學(xué)習(xí)交流,金黃色葡萄球菌檢查

16、,43,PPT學(xué)習(xí)交流,金黃色葡萄球菌檢查,檢驗(yàn)程序 取供試品，照附錄“微生物計(jì)數(shù)法”制成1：10供試液。 相當(dāng)于1g或1mL供試品的供試液，接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗(yàn)確定的）的胰酪大豆胨肉湯中，混勻。3035培養(yǎng)1824小時(shí)。 修訂前 為亞碲酸鈉（鉀）肉湯或營養(yǎng)肉湯 選擇和分離培養(yǎng) 取上述預(yù)培養(yǎng)物劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂平板上。 3035培養(yǎng)1872小時(shí)。,44,PPT學(xué)習(xí)交流,金黃色葡萄球菌檢查,結(jié)果判斷 若甘露醇氯化鈉瓊脂平板上有黃色菌落或外周有黃色環(huán)的白色菌落生長，應(yīng)進(jìn)行分離、純化及適宜的鑒定試驗(yàn), 確證。 若平板上沒有與上述形態(tài)特征相符或疑似的菌落生長，或雖有相符或 疑似的菌

17、落生長但鑒定結(jié)果為陰性，判供試品未檢出金黃色葡萄球菌。,45,PPT學(xué)習(xí)交流,梭菌,為一大群厭氧或微需氧的粗長芽孢桿菌。 由于定義的簡單，梭菌屬是細(xì)菌中最大的屬。 大多數(shù)梭菌的形態(tài)都很復(fù)雜多變，即使在同一菌株其形態(tài)也并非經(jīng)常恒定，甚至每次培養(yǎng)都有可能變化。,46,PPT學(xué)習(xí)交流,梭菌檢查,修訂版同2010版 檢驗(yàn)程序 取1:10供試液至梭菌增菌培養(yǎng)基48h 哥倫比亞瓊脂48-72h 取供試品照附錄“微生物計(jì)數(shù)法”制成1：10 供試液。 取相當(dāng)于1g或1mL供試品的供試液2份，其中1份置80保溫10分 鐘后迅速冷卻。 將上述2份供試液分別接種至適宜體積的梭菌增菌培養(yǎng)基中。 置厭氧條件下3035培

18、養(yǎng)48小時(shí)。 取上述每一培養(yǎng)物少量，分別涂抹接種于哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基平板上 厭氧條件下3035培養(yǎng)4872小時(shí)。 鑒定試驗(yàn) 過氧化氫酶試驗(yàn),47,PPT學(xué)習(xí)交流,梭菌檢查,結(jié)果判斷 -若哥倫比亞瓊脂平板上有帶或不帶芽孢的厭氧桿菌生長， 且過氧化氫酶反應(yīng)陰性,應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行適宜的鑒定試驗(yàn), 確證是否為梭菌. -哥倫比亞瓊脂平板上沒有厭氧桿菌生長. -或雖有相符或疑似的菌落生長但鑒定結(jié)果為陰性. -或過氧化氫酶反應(yīng)陽性，判供試品未檢出梭菌。,48,PPT學(xué)習(xí)交流,白色念珠菌,形態(tài)特征 白色念珠菌又稱白色假絲酵母菌，該菌屬于真菌門、半知菌亞門、芽生菌綱、隱球酵母目、隱球酵母科、念球菌屬。 營養(yǎng)要求不高，最適pH4.0-6.0,在一般細(xì)菌培養(yǎng)基上即可生長。 在不同的培養(yǎng)基上真菌菌落形態(tài)變化很大。,49,PPT學(xué)習(xí)交流,白色念珠菌檢查,檢驗(yàn)程序 取供試品，照“非無菌產(chǎn)品微生物檢查：微生物計(jì)數(shù)法” 制成1：10供試液。 取相當(dāng)于1g或1mL供試品的供試液，接種到100mL 沙氏葡萄糖肉湯中. 3035培養(yǎng)35天。 取上述預(yù)培養(yǎng)物劃線接種于沙氏葡萄糖瓊脂平板上，3035培養(yǎng)2448小時(shí)。 典型特征 白色念珠菌在沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長的菌落呈乳白色，