《中國藥典》2015年版微生物基本知識解析.ppt

1、微生物檢查體系的調(diào)整,微生物檢測環(huán)境變化,控制菌項目變化,非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法,通用要求要點： (1) 微生物計數(shù)法系用于能在有氧條件下生長的嗜溫細菌和真菌的計數(shù)。 本檢查法可采用替代檢查方法，包括自動檢測法，但必須證明其替代方法等效于藥典規(guī)定的檢查方法。（9201）藥品微生物檢驗替代方法驗證指導原則 (2) 環(huán)境潔凈度應符合要求。定期檢測：不低于B級的單向流空氣區(qū)域、工作臺面、環(huán)境。參考USP1117實驗室分區(qū)原則。 (3) 前處理：供試品的抗菌活性，中和劑和滅活劑的有效性及無毒性。表面活性劑的無毒性及與相容性。 (4) 方法選擇：根據(jù)供試品理化特性和微生物限度標準等因素選

2、擇。（平皿法、薄膜過濾法和MPN法） (5) 菌種管理：（9203）藥品微生物實驗室質(zhì)量管理指導原則關(guān)于菌株管理的要求。 (6) 陰性對照：微生物檢查需進行陰性對照試驗。如果對照有菌生長，應進行偏差調(diào)查。,試驗菌,微生物計數(shù)用培養(yǎng)基,培養(yǎng)基適用性檢查,培養(yǎng)基適用性檢查,計數(shù)方法適用性試驗,2、接種和稀釋,接種和稀釋,消除供試品的抑菌活性的方法 （1）增加稀釋劑和培養(yǎng)基的用量； （2）加入中和劑或滅活劑； （3）采用薄膜過濾法和沖洗； （4）綜合上述措施。 根據(jù)供試品須符合的微生物限度標準和菌數(shù)報告規(guī)則，在不影響檢驗結(jié)果判斷的前提下，應采用能使微生物生長的更高稀釋級的供試液進行方法適用性試驗。若

3、方法適用性試驗符合要求，應以該稀釋級供試液作為最低稀釋級的供試液進行供試品檢測。,培養(yǎng)條件,結(jié)果判斷,供試品檢查部分 1、操作,供試品檢查部分 2、培養(yǎng),供試品檢查部分-結(jié)果判斷,供試品檢查部分-結(jié)果判斷,供試品檢查部分-計數(shù)標準,非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法,通用要求要點： (1)控制菌檢查法系用于在規(guī)定的試驗條件下，檢查供試品中是否存在特定的微生物。本檢查法可采用替代檢查方法，包括自動檢測法，但必須證明其替代方法等效于藥典規(guī)定的檢查方法。（9201）藥品微生物檢驗替代方法驗證指導原則。 (2)供試液制備及實驗環(huán)境要求同非無菌產(chǎn)品微生物檢查：微生物計數(shù)法參考USP1117實驗室分區(qū)

4、原則。 (3)前處理：供試品的抗菌活性，中和劑和滅活劑的有效性及無毒性。表面活性劑的無毒性及與相容性。 (4)在各控制菌項下：生化實驗和“應進行分離、純化及適宜的鑒定實驗?！备臑檩^少的生化實驗或“采用其它適宜方法進一步鑒定?！?控制菌結(jié)果判斷趨向多樣化, 控制菌檢查中將原來大腸菌群的檢測改為耐膽鹽的革蘭氏陰性菌，另外培養(yǎng)基體系也有較明顯的變化，較少的生化實驗或采用其它適宜方法進一步鑒定（鏡檢、生化、色譜光譜技術(shù)、分子生物學等）,供試品檢查部分-耐膽鹽革蘭陰性菌,大腸菌群的定義是指在37生長時能發(fā)酵乳糖，24h內(nèi)產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭陰性、氧化酶陰性、需氧或兼性厭氧的無芽孢桿菌。它不是分類學上的名稱。符

5、合上述定義的菌除埃希菌屬外，還包括腸桿菌科的腸桿菌屬、枸櫞酸菌屬、克雷伯菌屬。,供試品檢查部分-耐膽鹽革蘭陰性菌,取供試品，用胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基作為稀釋劑照“非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法”（通則1105）制成1:10供試液，混勻，在2025 培養(yǎng)，培養(yǎng)時間應使供試品中的細菌充分恢復但不繁殖（約2小時）。 取相當于1g或1ml供試品的上述預培養(yǎng)物接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗確定）腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，3035 培養(yǎng)2448小時后，劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上，3035 培養(yǎng)1824小時。如果平板上無菌落生長，判供試品未檢出耐膽鹽革蘭陰性菌。 1:10TSB供試液（20-2

6、5 2h） 腸道增菌肉湯 紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂 （大腸、銅綠+/金葡-） （大腸、銅綠+指示） 24-48h 18-24h,供試品檢查部分-耐膽鹽革蘭陰性菌,選擇和分離培養(yǎng) 取相當于0.1g、0.01g和0.001g(或0.1ml、0.01ml和0.001ml）供試品的預培養(yǎng)物或其稀釋液分別接種至適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗確定）腸道增菌液體培養(yǎng)基中，3035培養(yǎng)2448h。上述每一培養(yǎng)物分別劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，3035 培養(yǎng)1824h。 結(jié)果判斷 若紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長，則對應培養(yǎng)管為陽性，否則為陰性。根據(jù)各培養(yǎng)管檢查結(jié)果，從表二查對1g或1ml供試品中

7、含有耐膽鹽革蘭陰性菌的可能菌數(shù)。 表2 耐膽鹽革蘭陰性菌的可能菌數(shù)（N） - 各供試品量的檢查結(jié)果 -每1g（或1ml）供試品種可能的菌數(shù)cfu 0.1g或0.1ml 0.01g或 0.001g或 - + + + N 103 + + - 102 N 103 + - - 10N102 - - - N 10 -,供試品檢查部分-大腸埃希菌,大腸埃希菌室腸桿菌科埃希菌屬的代表種 大腸埃希菌室兩端鈍圓的短小直桿菌，單個或成對，格蘭陰性。無芽孢，多鞭毛，培養(yǎng)最適溫度為37 ，可在1546 生長，兼性厭氧。 取1:10供試液至tsb（適宜體積）（18-24h） MaC肉湯 MaC瓊脂 （大腸+/金葡-）

8、（大腸+指示） 42-44 24-48h 18-72h 結(jié)果判斷 若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長，應進行分離、純化及適宜的鑒定試驗，確證是否為大腸埃希菌；若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結(jié)果為陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌。,供試品檢查部分-沙門菌,沙門菌為革蘭陰性菌，無芽孢，菌體通常（0.40.9）um（13）um，兩端鈍圓。需氧或兼性厭氧，1042皆可生長，最適溫度37 . 加入10g供試品的TSB供試液（18-24h) RV肉湯 XLD瓊脂 （沙門+/金葡-) (沙門+/金葡-） 18-24h 18-48h 結(jié)果判斷 若木糖賴氨酸脫氧但酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上有

9、疑似菌落生長，且三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基的斜面為紅色、底面為黃色，或斜面黃色、底層黃色或黑色，應進一步進行適宜的鑒定試驗，確證是否為沙門菌。若果平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結(jié)果為陰性，或三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基的斜面未見紅色、底層未見黃色；或斜面黃色、底層未見黃色黑色，判供試品未檢出沙門菌。,非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：非無菌藥品微生物限度標準,表1 非無菌化學藥品制劑、生物制品制劑、不含藥材原粉的中藥制劑微生物限度標準,非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：非無菌藥品微生物限度標準,表2 非無菌含藥材原粉的中藥制劑微生物限度標準,非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：非無菌藥品微生物限度標準,表3 非無菌的藥用原料及輔料

10、微生物限度標準（新增） 表4 中藥提取物及中藥飲片的微生物限度標準（新增）,非無菌藥品微生物限度標準,限度標準由“數(shù)量”向“數(shù)量級”轉(zhuǎn)變 非無菌藥品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)照“非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法”（通則1105）檢查；非無菌藥品的控制菌照“非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法”（通則1106）檢查。各品種項下規(guī)定的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)標準解釋如下： 101 cfu: 可接受的最大菌數(shù)為20; 102 cfu: 可接受的最大菌數(shù)為200; 103 cfu: 可接受的最大菌數(shù)為2000:以此類推。 雖然擴大了限度的標準，但是對過程控制的要求有了很大的提高，培養(yǎng)基

11、的營養(yǎng)能力也有了很多的提高，未來將向參數(shù)放行方向發(fā)展。,1101 無菌檢查法-培養(yǎng)基,硫乙醇鹽酸流體培養(yǎng)基主要用于厭氧菌的培養(yǎng)，也可用于需氧菌培養(yǎng)；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基用于真菌和需氧菌的培養(yǎng)。,培養(yǎng)基體系與國際接軌，改變以往微生物分類培養(yǎng)的錯誤，正確考慮培養(yǎng)基的廣譜性。否定了檢查中對微生物分類培養(yǎng)的概念，即某種污染了需氧菌的供試品，無論被接種在TSB中，均可被檢出，不容易漏檢。,1101 無菌檢查法-培養(yǎng)基的適用性檢查,本檢查可在供試品的無菌檢查前或與供試品的無菌檢查同時進行。 1、無菌性檢查 每批培養(yǎng)基隨機取不少于五支（瓶），置各培養(yǎng)基規(guī)定的溫度培養(yǎng)14天，應無菌生長。 2、靈敏度檢查-培養(yǎng)

12、基靈敏度檢查所用菌株傳代次數(shù)不得超過5代。,將枯草芽孢桿菌移到TSB靈敏度檢查中，能夠確保在兩種培養(yǎng)基中需氣菌都能夠生長,1101 無菌檢查法-培養(yǎng)基靈敏度檢查,12ml的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基7支，分別接種小于100cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌各2支，另1支不接種作為空白對照，培養(yǎng)3天。 9ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基7支，分別接種小于100cfu的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接種作為空白對照，培養(yǎng)5天。 對照管無菌生長，若加菌的培養(yǎng)基管生長良好，判該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合規(guī)定。,1101 無菌檢查法-方法適用性試驗,藥典規(guī)定 進行產(chǎn)品無菌檢查時，應進行方法

13、適用性檢驗，以確認所采用的方法適合于該產(chǎn)品的無菌檢查。 若檢驗程序或產(chǎn)品發(fā)生變化可能影響檢驗結(jié)果時，應重新進行方法適用性試驗。,選用菌株的原則 代表性 普遍性 低或非致病性 標準菌株（或藥品中常見的污染菌） 試驗方法：薄膜過濾法和直接接種法?？膳c供試品的無菌檢查同時進行。,1101 無菌檢查法-供試品無菌檢查,無菌檢查法包括薄膜過濾法和直接接種法。 只要供試品允許，應采用薄膜過濾法。 供試品檢查方法應與方法適用性確認的方法相同。 若是表面活性劑、滅活劑、中和劑等試劑，應證明其有效性，且對微生物無毒性。 檢驗數(shù)量及檢驗量,表1、表2中最少檢驗數(shù)量不包括陽性對照試驗的供試品用量,1101 無菌檢查

14、法-檢驗量,表1：針對注冊性質(zhì) 表2、針對委托、進口、國評等性質(zhì) 具體檢驗量要看檢品的裝量來綜合三個表：如果是注冊的則看表1和表3，若果是其他的則看表2和表3 例1：注射用頭孢呋辛鈉，規(guī)格0.25g，注冊 查表1得 批產(chǎn)量：500，接種每種培養(yǎng)基所需的最少檢驗數(shù)量：2或20個（取較少者，目前我們都是取20個）查表3得 每支供試品接入每種培養(yǎng)基的最少量：半量（即一瓶樣品可以對半接種至每種培養(yǎng)基） 綜上述得：取30瓶樣品，分三份接種至每種培養(yǎng)基里面。 例2：注射用宮縮素，規(guī)格10單位，注冊 查表1得 批產(chǎn)量：500，接種每種培養(yǎng)基所需的最少檢驗數(shù)量：2或20個（取較少者，目前我們都是取20個）查表

15、3得 每支供試品接入每種培養(yǎng)基的最少量：全量 綜上述得：取60瓶樣品，分三份接種至每種培養(yǎng)基里面。 例3： 左卡尼汀注射液，規(guī)格5ml：1g左卡尼汀，進口 查表2得 供試品最少檢查數(shù)量（瓶或支）：10支 查表3得 每支供試品接入每種培養(yǎng)基的最少量：半量 綜上述得：取15支樣品，分三份接種至每種培養(yǎng)基里面。,1101 無菌檢查法-供試品無菌檢查,陽性對照試驗 無抑制作用的供試品以金色葡萄球菌為對照菌； 抗革蘭陽性為主的供試品，以金黃色葡萄球菌為對照菌； 抗革蘭陰性為主的供試品以大腸埃希菌為對照菌； 抗氧菌的供試品，以生孢梭菌為對照菌； 抗真菌的供試品，以白色念珠菌為對照菌。 陰性對照試驗 供試品無菌檢查時，應取相應溶劑和稀釋液、沖洗液同法操作，作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。,1101 無菌檢查法-供試品無菌檢查-薄膜過濾法,操作方法:將規(guī)定量的供試品溶液按薄膜過濾法過濾，沖洗（按適應性試驗確認的方法）。將培養(yǎng)基加至濾筒內(nèi) 檢查要點：采用封閉式包，薄膜過濾器。濾膜孔徑應不大于0.45um。根據(jù)供試品特性選擇濾膜材質(zhì)。濾過過程保持液面覆蓋整張膜。每膜總沖洗量不得過1000ml。,1101 無菌檢查法-供試品無菌檢查-培養(yǎng)及觀察,1101 無菌檢查法-結(jié)果判斷,陽性對照管應生長良好，