第三章 氨基酸.ppt

1、第三章 蛋 白 質(zhì),第一節(jié) 蛋白質(zhì)通論 一組成 ：蛋白質(zhì)分子是由氨基酸 （20種）首尾相連而成的 共價(jià)多肽鏈。 元素：C、H、O、N； S、P、Fe、Cu、Mg、 I、Zn、Al等 凱氏 (Kjedahl) 定氮法: 蛋白質(zhì)含量 = 蛋白氮 6.25,二分類： 單純（簡(jiǎn)單）蛋白質(zhì) 按溶解性分類 按組成分： 綴合（結(jié)合）蛋白質(zhì) 按非氨基酸成分分類 纖維狀蛋白質(zhì) 2按形狀和溶解度分： 球狀蛋白質(zhì) 膜蛋白 3按生物功能分： （蛋白質(zhì)的多樣性）,三蛋白質(zhì)的大小和分子量： 從大約60001 106 Da（百萬(wàn)）或更大一些。 對(duì)于不含輔基的簡(jiǎn)單蛋白質(zhì), 用 110 除它的相對(duì)分子質(zhì)量即可約略估計(jì)其氨基酸殘

2、基的數(shù)目。,四蛋白質(zhì)的構(gòu)象 和組織層次： 每一種天然蛋白質(zhì)都有自己特有的空間結(jié)構(gòu)或稱三維結(jié)構(gòu), 這種三維結(jié)構(gòu)通常被稱為蛋白質(zhì)的構(gòu)象。,第二節(jié)氨 基 酸 一蛋白質(zhì)的水解： 完全（徹底）水解 AA 不完全（部分）水解 AA 肽 酸水解 方法 堿水解 酶水解,二氨基酸的一般結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)氨基酸（基本AA，common, standard amino acid)：20種 非蛋白質(zhì)氨基酸：200多種,人類對(duì)aa的營(yíng)養(yǎng)需求,人類自身能合成,人類自身不能合成或不能足量合成，必須依賴食物供給。,Met Trp Lys Val Ile Leu Phe Thr (His),Gly Ala Ser Tyr Cys P

3、ro Asn Asp Glu Gln Arg,組成蛋白質(zhì)的氨基酸都為a-氨基酸（除Pro外）,C,酸,氨,不同的 aa 在于 R基團(tuán) 的不同,一. 氨基酸的結(jié)構(gòu),組成蛋白質(zhì)的氨基酸基本上都是L型（除Gly外）,D型 與 L型,R group,Amino group,Carboxylic group,L-Form Amino Acid Structure,H = Glycine,CH3 = Alanine,Mirror Images of Amino Acid,Mirror image,Same chemical properties,Stereo isomers,三. 分類 1. Classi

4、fication of Amino Acids by Chemical construction,要求：？,-C-C-CONH2,-C-CONH2,-C-COOH,-C-C-COOH,-H,-CH3,-C-OH,-C-SH,-C-C-S-C,-C-C-C-C-NH3+,Aliphatic,Amide,Acidic,Imino, Circular,Basic,Sulfur,Hydroxy,Aromatic,POLAR,NON- POLAR,Tyr,His,Gly,Acidic,Neutral,Basic,Asp,Glu,Gln,Cys,Asn,Ser,Thr,Lys,Arg,Ala,Val,Il

5、e,Leu,Met,Phe,Trp,Pro,2. Classification of Amino Acids by Polarity,Polar or non-polar, it is the bases of the amino acid properties.,稀有的蛋白質(zhì)氨基酸,通常是常見氨基酸的衍生物。 如:4-羥脯氨酸、5-羥賴氨酸,非蛋白質(zhì)氨基酸,鳥氨酸 (Orn),瓜氨酸,四氨基酸的酸堿性質(zhì)： 1. 氨基酸是兼性離子（偶極離子 ）： 熔點(diǎn)很高, 一般在 200 以上 ？ 氨基酸能使水的介電常數(shù)增高 ？ 2. 氨基酸的二性解離： 氨基酸是一類兩性電解質(zhì)。氨基酸完全質(zhì)子化時(shí), 可以看

6、成是多元酸, 側(cè)鏈不解離的中性氨基酸可看作二元酸, 酸性氨基酸和堿性氨基酸可視為三元酸。,Proton： abundant and small, affects the charge of a molecule,H+,lone pair electrons,Ampholyte contains both positive and negative groups on its molecule,Proton Is Adsorbed or Desorbed,pKa,pKa,COOH,N H3+,Acidic environment,Neutral environment,Alkaline envi

7、ronment,A+,A-,Ao,pH = pKa + log質(zhì)子受體/質(zhì)子供體,OH ,pK1,pK2,pH,pI,Isoelectric point =,Amino Acids Isoelectric point (pI),Ao=A-,A+=Ao,pKa = 1.72.4,pKa = 3.94.3,pKa = 6.0,pKa = 8.3,pKa = 10,pKa = 8.811,pKa = 1012.5,Smaller pKa releases proton easier,Residues on amino acids can release or accept protons,pKa o

8、f Amino Acid Residues,Only His has the residue with a neutral pKa (imidazole),Amino acids-COOH-NH2-R GlyG2.349.60 AlaA2.349.69 ValV2.329.62 LeuL2.369.68 IleI2.369.68 SerS2.219.15 ThrT2.6310.4 MetM2.289.21 PheF1.839.13 TrpW2.389.39 AsnN2.028.80 GlnQ2.179.13 ProP1.9910.6 AspD2.099.823.86 GluE2.199.674

9、.25 HisH1.829.176.0 CysC1.7110.88.33 TyrY2.209.1110.07 LysK2.188.9510.53 ArgR2.179.0412.48,pK1,pK1,pK2,pK2,pK3,pI,pI ?,three pKa,two pKa,?,?,pKa of Amino Acids,A+,Ao,A-,A2-,pK1 = 2.1,pK2 = 3.9,pK3 = 9.8,= 3.0,first,second,third,Isoelectric point,Isoelectric point is the average of the two pKa flanki

10、ng the zero net-charged form,Aspartic acid,OH,20種氨基酸的pI,Conclusion,pH pI 帶負(fù)電，移向正極,pH pI 帶正電，移向負(fù)極,pH = pI 不帶電，不移動(dòng),4. 氨基酸的甲醛滴定： 氨基酸能直接用酸、堿滴定來(lái)進(jìn)行定量測(cè)定嗎？ pH = pKa2 + logH2NCH2COO-/H3N+CH2COO- 甲醛與H2NCH2COO- 結(jié)合, 有效地減低了后者的濃度, 所以，H2NCH2COO -/H3N+CH2 COO - 的比值總要比不存在甲醛的情況下小得多。,五氨基酸的化學(xué)反應(yīng)： （一）NH3參加的反應(yīng)： （二）COOH參加的

11、反應(yīng)： （三）NH3 COOH的反應(yīng)： （四）R基參加的反應(yīng)：,（一）NH3參加的反應(yīng)： 室溫下與HNO2反應(yīng)（脫氨）: Van Slyke 法測(cè)定氨基氮的基礎(chǔ) 2. 與?；噭┓磻?yīng)（在肽合成中用于NH3的保護(hù)): 氨基酸的氨基與酰氯或酸酐在弱堿溶液中發(fā)生作用時(shí), 氨基即被酰基化.,?；磻?yīng),常用的?；噭?,與丹磺酰氯（DNS-Cl）的反應(yīng),DNS-氨基酸,用途：反應(yīng)用于蛋白質(zhì)的N-末端的測(cè)定。,在弱堿溶液中，氨基酸的-氨基與2,4-二硝基氟苯(DNFB) 反應(yīng)，生成黃色的二硝基苯氨基酸（DNP-AA）。,此反應(yīng)最初被Sanger 用于測(cè)定肽鏈 N-端氨基酸,3. 烴基化反應(yīng)：FDNB、PI

12、TCEdman降解,Edman反應(yīng),4. 形成西佛堿反應(yīng)：與醛反應(yīng) 氨基酸的-氨基能與醛類化合物反應(yīng)生成弱堿西佛堿。西佛堿是以氨基酸為底物的某些酶促反應(yīng)（如：轉(zhuǎn)氨反應(yīng)）的中間物。,5. 酶促脫氨基反應(yīng)： 氨基酸在體內(nèi)經(jīng)氨基酸氧化酶催化（即脫-氨基）而轉(zhuǎn)變成酮酸。,氨基酸氧化酶,6與熒光試劑反應(yīng)： 用于蛋白質(zhì)的標(biāo)記，修飾，游離氨的測(cè)定（Lys） 熒光胺： + RNH2 PH9，室溫 過(guò)量的熒光胺在1分鐘內(nèi)被水解。,激發(fā)=390nm，發(fā)射=475nm,熒光性,鄰苯二甲醛： + RNH2 + SH-R,激發(fā)=340nm，發(fā)射=455nm,熒光性,（二）COOH參加的反應(yīng)： 成鹽和成酯反應(yīng)（COOH保

13、護(hù)） 當(dāng)氨基酸的羧基變成甲酯、乙酯或鈉鹽后, 羧基的化學(xué)反應(yīng)性能即被掩蔽羧基被保護(hù), 而氨基的化學(xué)反應(yīng)性能得到加強(qiáng)氨基被活化, 容易和?；驘N基結(jié)合, 這就是為什么氨基酸的?；蜔N基化需要在堿性溶液中進(jìn)行的原因。,成酰氯反應(yīng)（COOH活化） 氨基酸的氨基用適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基（如：芐氧甲?；┍Ｗo(hù)后, 其羧基可與二氯亞砜或五氯化磷作用生成酰氯，使氨基酸的羧基活化, 使它容易與另一氨基酸的氨基結(jié)合。,酶促脫羧和化學(xué)脫羧反應(yīng)： 在體內(nèi),經(jīng)氨基酸脫羧酶催化，釋放CO2，生成相應(yīng)的一級(jí)胺。 在體外: NH2CHCOOH Ba(OH)2 ， RCH2NH2 + CO2 R 疊氮反應(yīng)（COOH活化） 氨基酸的氨

14、基通過(guò)?；右员Ｗo(hù), 羧基經(jīng)酯化轉(zhuǎn)變?yōu)榧柞? 然后與肼和亞硝酸反應(yīng)即變成疊氮化合物。此反應(yīng)使氨基酸的羧基活化，用于肽的人工合成。,疊氮反應(yīng),?；被峒柞??；被狨ｋ??；被岑B氮,反應(yīng)分2步：,茚三酮反應(yīng)常用于aa的定性和定量分析,（三）NH3和COOH共同參加的反應(yīng)： 1. 與茚三酮反應(yīng)：,Pro的茚三酮反應(yīng)呈黃色, =440nm,=570nm,（三）NH3和COOH共同參加的反應(yīng)： 1. 成肽反應(yīng)： 一個(gè)AA的氨基與另一AA的羧基可以縮合成肽，形成的鍵稱為肽鍵。,（四）R基參加的反應(yīng)： 氨基酸側(cè)鏈上的功能團(tuán)也能發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，如：羥基、酚基、巰基 ( 包括二硫鍵 ) 、吲哚基、咪唑基

15、、胍基、甲硫基、非-NH3、非-COOH等。 什么是蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾 ？,（四）R基參加的反應(yīng)： 1. Tyr： （1）碘化或硝化分別生成一腆Tyr、二腆Tyr、一硝基Tyr、二硝基Tyr； （2）Pauly反應(yīng)：Tyr的酚基與重氮化合物 (如：對(duì)氨基苯磺酸的重氮鹽) 結(jié)合生成橘黃色的化合物，可用于鑒定Tyr。,（3）Millon反應(yīng)（酚基反應(yīng)）： Tyr + Hg(NO3)2 (含HNO2的HNO3溶液) 紅色化合物 （4）Follin反應(yīng)（酚基和吲哚基）：可用于測(cè)定Tyr和Trp含量。 Tyr(Trp) + 磷鎢酸和磷鉬酸 還原 蘭色化合物 （5）黃色反應(yīng)（苯環(huán)反應(yīng)）： Tyr(Trp,

16、Phe) 濃HNO3 硝基苯衍生物（黃色）,2. His： Pauly反應(yīng)：呈棕紅色 3. Arg： （1）與環(huán)已二酮反應(yīng)：Arg的胍基在硼酸鈉buffer（pH8-9,25-35）中，與1，2-環(huán)已二酮反應(yīng),生成縮合物。（P140） （2）坂口反應(yīng)（Sakaguchi）（胍基反應(yīng)） Arg + -萘酚 紅色化合物 NaClO N2 + NaCl + H2O,4. Trp： （1）被N溴代琥珀酰亞胺氧化，此反應(yīng)可用于分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)中Trp的含量，并能在Trp和Tyr殘基處選擇性化學(xué)斷裂肽鍵。 （2） Follin反應(yīng): （3） 黃色反應(yīng): 5. Met： 碘甲烷反應(yīng)（用于同位素標(biāo)記）：

17、Met的甲硫基是一個(gè)很強(qiáng)的親核基團(tuán)，可與烴化試劑（如：碘甲烷）形成锍鹽，此反應(yīng)可被巰基試劑逆轉(zhuǎn)。在逆轉(zhuǎn)反應(yīng)中, 原有的甲基和新加入的甲基除去的機(jī)會(huì)是相等的, 因此當(dāng)用14C標(biāo)記的甲基腆處理時(shí), 獲得的Met將有 50% 是同位素標(biāo)記的。,6. Cys： （1）與碘乙酸反應(yīng)： Cys側(cè)鏈上的-SH, 反應(yīng)性能很高, 在微堿性 pH 下, -SH 基發(fā)生解離形成硫醇陰離子（-CH2-S-）。此陰離子是-SH的反應(yīng)形式, 能與鹵化烷（如：腆乙酸、腆乙酰胺、甲基腆等）迅速反應(yīng), 生成相應(yīng)的穩(wěn)定烷基衍生物。 （2）與氮丙啶反應(yīng)： 生成的側(cè)鏈帶有正電荷，為胰酶水解肽鏈提供了一個(gè)新的位點(diǎn)，在蛋白質(zhì)測(cè)序中很有

18、用。 同時(shí)，此反應(yīng)也可用來(lái)保護(hù)肽鏈上的-SH，以防止被重新氧化成二硫鍵。,（3）與金屬離子反應(yīng) -SH能和各種金屬離子形成穩(wěn)定程度不等的絡(luò)合物。常用的有 R-Hg+ 型的一價(jià)有機(jī)汞制劑（如：對(duì)氯汞苯甲酸）形成絡(luò)合物。 由于許多蛋白質(zhì), 如: SH 酶, 其活性中心涉及-SH, 當(dāng)遇到重金屬離子而生成硫醇鹽時(shí), 將導(dǎo)致酶的失活, 因此,制備這類蛋白質(zhì)時(shí)應(yīng)避免重金屬離子。 （4）Ellman反應(yīng)（二硫硝基苯甲酸，DTNB） Cys與二硫硝基苯甲酸 (DTNB) 或稱 Ellman 試劑發(fā)生硫醇-二硫化物交換反應(yīng)。 反應(yīng)中 1 分子的Cys引起1分子的硫硝基苯甲酸的釋放。它在 pH 8.0 時(shí), 在 412nm 波長(zhǎng)處有強(qiáng)烈的光吸收, 因此可利用分光光度法定量測(cè)定-SH。,硫硝基苯甲酸,測(cè)定Cys含量（pH8.0，412nm的摩爾消光系數(shù)=13600）,二硫硝基苯甲酸（DTNB）,（5）氧化和還原（O2，過(guò)甲酸，巰基乙醇等） -SH很容易受空氣或其他氧化劑氧化。當(dāng)有痕量的金屬離子，如：Cu2+,Fe2+,Co2+ 或 Mn2+ 存在下，-SH的空氣氧化將顯著提高。 硫醇氧化中一般遇到的只有兩種氧化產(chǎn)物：二硫化物和磺酸。 前者是硫醇的空氣氧化產(chǎn)物，例如：半胱氨酸氧化成胱氨酸，后者是在更強(qiáng)的氧化劑作用下產(chǎn)生的, 例如：用過(guò)