電泳和電色譜.ppt

1、1,9 電泳和電色譜Electrophoresis and electrophoretic chromatograph,2,電泳概念,Arne Tiselius物理化學家、諾貝爾獎金獲得者 定義荷電的膠體粒子在電場中的移動； 電泳決定于環(huán)繞每個離子的離子霧中的擴散雙電層，離子尺寸越大、溶液中的離子強度越高時，電泳現(xiàn)象變得越明顯。 因此，電泳現(xiàn)象中的表面電勢和雙電層的因素起著決定性的作用。,3,電泳概念,電泳與色譜原理結合可以派生多種復合分離方法，如電泳色譜和電色譜。 電泳色譜：將溶質(zhì)的電動遷移和色譜分離作用相結合 電色譜：利用 電滲作用 驅(qū)動流動相流動，分離作用主要源于 溶質(zhì)在色譜固定相和流動

2、相間的分配平衡特性 多數(shù)情況下二者無嚴格區(qū)分，均稱為電色譜,4,9.1 基礎理論,電泳的簡單原理 蛋白質(zhì)、核酸、多糖等常以顆粒分散在溶液中，它們的凈電荷取決于介質(zhì)的H+濃度或與其它大分子的相互作用。 帶電粒子在電場中的遷移方式主要依據(jù)分子尺寸大小和形狀、分子所帶電荷或分子的生物學與化學特性。,5,albumin白蛋白 Globulin球蛋白 Serum血清,6,9.1.1 電泳速度,9.1.1.1 自由溶液中的電泳速度 Stokes Law（斯托克斯定律）,7,Stokes Law（斯托克斯定律）,如果把生物大分子的膠體溶液放在一個沒有干擾的電場中，使顆粒具有恒定遷移速率的驅(qū)動力來自于顆粒上的

3、 有效電荷Z 和 電位梯度E，它們與介質(zhì)的摩擦阻力f相抗衡，這種抗衡服從斯托克斯定律： f = E Z e f= 6v r v是介質(zhì)粘度為中半徑為r的顆粒的移動速度。 但實際情況中， f還取決于凝膠厚度、顆粒尺寸、甚至是介質(zhì)的內(nèi)滲等。,8,9.1.1 電泳速度,當電場力和黏性阻力達到平衡時，即f =f 時，荷電溶質(zhì)恒速泳動 U0為電解質(zhì)溶質(zhì)的遷移率，是單位電場強度下的泳動速度（淌度）,9,雙電層厚度 帶電粒子遷移率,10,電泳遷移率,電泳遷移率（mobility）: 在電位梯度E的影響下，帶電顆粒在時間t中的遷移距離d。 其單位是cm2sec-1 V-1 電泳遷移率的不同提供了從混合物中分離不

4、同物質(zhì)的基礎,11,9.1.1.2 凝膠中的電泳速度,聚丙烯酰胺凝膠的濃度,Tg 單位質(zhì)量分數(shù) Cg 交聯(lián)劑質(zhì)量分數(shù) a丙烯酰胺單體質(zhì)量 b交聯(lián)劑單體質(zhì)量 m緩沖液質(zhì)量,Tg與u有關,12,凝膠電泳遷移率 u p365 Ferguson線圖 當Cg一定時，凝膠電泳遷移率lg u與Tg呈線性關系。,13,電泳的大致分類,依據(jù)電泳原理，現(xiàn)有三種形式的電泳分離系統(tǒng) 移動界面電泳（moving boundary electrophoresis） 區(qū)帶電泳（zone electrophoresis ） 穩(wěn)態(tài)電泳（steady state electrophoresis ） 其中區(qū)帶電泳是目前常用的電泳系

5、統(tǒng)。,14,區(qū)帶電泳 表示在一個電場的作用下，在某一種支持介質(zhì)上（或均一的緩沖液中），能將混合物分離成若干區(qū)帶的電泳過程。 移界電泳（界面電泳）： 對物質(zhì)只起到部分分離的作用，混合物以同一界面移動，只有最前面的成分有部分提純的，其它則相互重疊。,15,等速電泳：在電泳達到平衡后，各區(qū)帶相隨，分成清晰的界面，以等速移動。它的區(qū)帶沒有重疊。 等電聚焦：利用各種具有不同等電點的載體兩性電解質(zhì)在電場中自動形成pH梯度，使被分離物各自移動到其等電點處而聚成很窄的區(qū)帶。,16,區(qū)帶電泳的主要技術,區(qū)帶電泳中的常用技術 載體電泳：粉末電泳、紙電泳、凝膠電泳、聚焦電泳 無載體電泳：自由電泳、毛細管電泳,17,

6、凝膠電泳的支持介質(zhì)： 聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamide gel, PAG） 由丙烯酰胺和交聯(lián)劑 N，N-甲叉雙丙烯酰胺在引發(fā)劑和增速劑的作用下，聚合而成； 瓊脂糖凝膠： 從瓊脂中精制分離出的膠狀多糖，其分子結構大部分是由1,3連接的-D吡喃半乳糖和1,4連接的3,6脫水-D吡喃半乳糖交替形成的；,9.2 凝膠電泳,18,丙烯酰胺的聚合,丙烯酰胺的聚合通常是由化學或光化學過程完成的，通常采用過硫酸銨、過硫酸鉀或核黃素（引發(fā)劑）來引發(fā)該過程；以N，N，N，N-四甲基乙二胺（TEMED）為增速劑。 該引發(fā)-增速的催化系統(tǒng)實質(zhì)是自由基催化的氧化-還原過程。 丙烯酰胺的化學聚合是由 過硫酸銨

7、 在堿性條件下，產(chǎn)生游離 氧自由基 引發(fā)單體丙烯酰胺成為自由基狀態(tài)，經(jīng)過一系列的自由基反應得到的聚合物；,19,影響聚合的主要因素,引發(fā)劑和增速劑的濃度： 濃度小易導致聚合速度慢； 濃度過大則易導致電泳時的燒膠以及電泳帶的畸變；一般控制使聚合過程在4060分鐘內(nèi)完成。 系統(tǒng)pH值： 酸性條件、堿性條件均可，但仍然存在一個最佳pH值，以獲得最佳的聚合結果；,20,影響聚合的主要因素,溫度：低溫下聚合導致凝膠變脆和混濁；適當提高溫度可以是凝膠透明而有彈性； 分子氧：分子氧的存在會阻礙凝膠的化學聚合；抽氣 系統(tǒng)純度：金屬離子會影響凝膠的聚合；,21,聚丙烯酰胺凝膠電泳中的分子篩效應,在使用凝膠介質(zhì)的

8、電泳中，由于電泳介質(zhì)具有高粘度和高的摩擦阻力，因此不僅可以防止對流，而且可以把擴散減到最小。 凝膠中的大分子分離取決于它的電荷、尺寸和形狀 凝膠的這種用于分離不同尺寸分子的特性是由于它的尺寸篩分能力（Size sieving capacity），這種現(xiàn)象被稱為分子篩效應（molecular sieving effect）,22,分子篩效應,圖中A，B，C均為陽離子，在直流電場作用下電泳情況示意圖 分子量大小依次為MA=MBMC，所帶電荷量相同QA=QB=QC。,23,瓊脂糖凝膠孔徑較大，0.075%瓊脂糖的孔徑為800nm，可以分析百萬道爾頓分子量的大分子，但分辨率較PAGE低。,24,電泳系

9、統(tǒng)的基本組成,電泳槽：是凝膠電泳系統(tǒng)的核心部分，管式電泳槽、垂直板電泳槽、水平板電泳槽 電源:聚丙烯酰胺凝膠電泳200600V，載體兩性電解質(zhì)等電聚焦電泳10002000V，固相梯度等電聚焦30008000V 外循環(huán)恒溫系統(tǒng):高電壓會產(chǎn)生高熱，需冷卻； 凝膠干燥器:用于電泳和染色后的干燥； 灌膠模具：制膠，玻璃板和梳子；,25,電泳轉(zhuǎn)移裝置：利用低電壓，大電流的直流電場，使凝膠電泳的分離區(qū)帶或電泳斑點轉(zhuǎn)移到特定的膜上，如PVDF膜 電泳洗脫儀：回收樣品 凝膠掃描和攝錄裝置：對電泳區(qū)帶進行掃描，從而給出定量的結果。,26,垂直電泳槽及灌膠模具,27,電泳的一般過程,28,29,SDS-聚丙烯酰胺

10、凝膠電泳（SDS-PAGE）,使用含有十二烷基硫酸鈉（ SDS）和還原劑（通常為巰基乙醇）的樣品處理液對蛋白質(zhì)樣品進行處理（一般煮沸35分鐘），通過加熱和SDS可以使蛋白質(zhì)變性，多亞基的蛋白質(zhì)也將解離為單亞基。同時還原劑可以切斷蛋白質(zhì)中的二硫鍵（使二硫鍵還原）。,30,經(jīng)過這樣處理的樣品中的肽鏈都是處于無二硫鍵連接的，分離的狀態(tài)。 由于SDS是帶有負電荷的分子，同時它有一個長的疏水尾巴，SDS通過疏水尾巴與肽鏈中的氨基酸的疏水側鏈結合，結合SDS的比率大約是一個蛋白質(zhì)分子中每兩個氨基酸殘基結合一分子的SDS。,31,垂直板電泳裝置,32,電泳過程中分子遷移的規(guī)律，小分子走在前頭，大分子滯后。電

11、泳凝膠相當于凝膠過濾中的一個帶孔膠粒。,混合樣品,帶孔膠,按分子大小分離,電泳方向,電泳,小分子,大分子,33,電泳后的凝膠經(jīng)考馬斯亮藍染色、脫色后的凝膠照片,34,夾在兩塊玻璃板之間的凝膠,電泳緩沖液,電泳緩沖液,加在槽中的經(jīng)SDS處理的樣品,分子量小,分子量大,電源,35,標準蛋白分子量,未知蛋白,在一定的凝膠濃度下，多肽鏈分子量的對數(shù)與多肽鏈的相對遷移率成線性關系，所以可以通過標準曲線求未知多肽鏈分子量。,相對遷移率,36,電泳緩沖液,凝膠,水平式電泳裝置,37,常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳,原理： 由于聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）是多孔介質(zhì)，不僅能防止對流，把擴散減少到最低；而且其孔徑大小

12、與生物大分子具有相似的數(shù)量級，能主動參與生物分子的分離，具有分子篩效應。 因此，在使用聚丙烯酰胺凝膠電泳進行蛋白質(zhì)分離時，在電泳過程中不僅取決于蛋白質(zhì)的電荷密度，還取決于蛋白質(zhì)的尺寸和形狀。 PAGE可以用圓盤電泳、垂直電泳或水平電泳,38,電泳前的準備工作,緩沖系統(tǒng)的選擇： 作用：保證蛋白質(zhì)的溶解性能、穩(wěn)定性以及生物活性的保持； 電泳時間和分辨率：從理論上講PAGE可以在任何pH進行，但實際上過酸或過堿的條件下將發(fā)生某種水解（脫酰胺）。因此，pH應限制在310之間。,39,緩沖系統(tǒng)的選擇原則,是兩種標準的對立權衡 如果緩沖液的pH選擇在 遠離 樣品中各種蛋白的等電點，蛋白質(zhì)分子所帶 電荷的密

13、度大 ，電泳時間短，區(qū)帶細而窄； 如果緩沖pH選擇在 靠近 被分離樣品的一種或幾種蛋白質(zhì)的等電點，則蛋白質(zhì)分子之間的電荷密度差別大，分辨率就高； 因此，常常選擇pH 8.09.5的緩沖，常用的緩沖液有Tris-甘氨酸（pH 8.39.5），Tris-硼酸(pH 8.39.3)和Tris-醋酸（pH 7.28.5）,40,離子強度的選擇,離子強度不宜過高，此時電導率低，產(chǎn)熱少，電泳速度快； 但也不可過低，必須具有一定的緩沖能力，過低的離子強度容易導致蛋白質(zhì)絮凝。 一般選擇緩沖液的離子強度為0.010.1 mol/L之間,41,凝膠濃度的選擇,由于PAGE電泳分離不僅取決于蛋白質(zhì)的電荷密度，而且取

14、決于分子的大小、形狀。因此，與凝膠的分子篩效應（即凝膠的孔徑與電泳的分辨率、電泳速度）密切相關。 根據(jù)凝膠孔徑與被分離分子的大小和形狀，可以將凝膠分為： 非排阻性凝膠（unrestrictive gel）: 濃度0.7 1.0%的瓊脂糖凝膠； 排阻性凝膠（restrictive gel）：濃度大于1%的瓊脂糖凝膠和常規(guī)PAGE,42,凝膠濃度太大，孔徑小于樣品分子尺寸，電泳時蛋白質(zhì)分子不能進入凝膠，樣品仍留在加樣位置； 凝膠濃度太小，孔徑太大，樣品中各種蛋白質(zhì)分子均隨緩沖液推進，不能得到很好的分離；,43,PAGE的具體操作過程,制膠：確定凝膠配方（凝膠、引發(fā)劑、增速劑的濃度和緩沖液），使用灌

15、膠模具灌膠； 樣品準備：選擇合適的樣品緩沖液、確定合適的樣品濃度（12mg/L，考染），加樣（溴酚藍）； 電泳：46小時，待溴酚藍前沿到達陽極底部； 檢測：紫外掃描或染色（考馬斯亮藍R-250、銀染色靈敏度比考染高100倍、熒光探針）； 照相、凝膠干燥： 定量測定：,44,SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳,十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-PAGE 主要用于測定蛋白質(zhì)亞基分子量以及未知蛋白質(zhì)分子量的測定； 特點：設備簡單、操作簡便、測定快速、重復性高、樣品無需純化。,45,SDS-PAGE 的原理,蛋白質(zhì)分子的解聚 SDS是一種陰離子去污劑，作為變性劑和助溶性試劑，能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵

16、，使分子去折疊，破壞蛋白質(zhì)分子的二級、三級結構； 而強還原劑，如二硫蘇糖醇、-巰基乙醇能使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵斷裂。,46,因此，在樣品和凝膠中加入SDS和還原劑后，蛋白質(zhì)分子被解聚為組成它們的多肽鏈，解聚后的氨基酸側鏈與SDS結合后，形成帶負電的蛋白質(zhì)-SDS膠束，所帶電荷遠遠超過了蛋白質(zhì)原有的電荷量，消除了不同分子間的電荷差異； 同時，蛋白質(zhì)-SDS聚合體的形狀也基本相同，這就消除了在電泳過程中分子形狀對遷移率的影響。,47,蛋白質(zhì)樣品用SDS處理后亞基的解聚和分子形狀的改變,48,未知蛋白質(zhì)分子量的測定,基于上述SDS-PAGE的原理介紹，我們可以利用SDS-PAGE電泳進行未知蛋白

17、質(zhì)的分子量測定； 以不同分子量的標準蛋白進行SDS-PAGE電泳得到不同標準蛋白的電泳遷移率，制作標準校正曲線，然后對未知蛋白在相同條件下進行SDS-PAGE電泳，測定遷移率，從標準曲線得到相應的分子量；,49,9.2 凝膠電泳,9.2.1 凝膠電泳 以制備為目的的凝膠電泳多采用圓柱形凝膠柱，電泳后將凝膠切成圓片 連續(xù)洗脫法較為方便易行,50,凝膠電泳原理,在凝膠電泳過程中，不同分子量的荷電溶質(zhì)在遷移過程中的泳動速度是不同的。 相對分子量較大的溶質(zhì)受凝膠阻滯作用較大，泳動速度慢；相反，分子量小的溶質(zhì)泳動速度較快。 經(jīng)過一定時間的電泳后，根據(jù)溶質(zhì)相對分子質(zhì)量的不同，凝膠中形成數(shù)條含不同溶質(zhì)的區(qū)帶

18、，實現(xiàn)溶質(zhì)間的分離。,51,凝膠電泳所使用的凝膠種類和濃度根據(jù)待分離料液中溶質(zhì)的相對分子量而異。 凝膠電泳的特點是凝膠柱中凝膠濃度和pH值均一。,52,9.2 凝膠電泳,9.2.2 不連續(xù)凝膠電泳 用濃度不同的兩層凝膠組成，上層凝膠濃度較低，孔徑較大，對溶質(zhì)的泳動無阻滯作用，溶質(zhì)在此層得到濃縮； 下層凝膠濃度較大，各組分根據(jù)其在凝膠中的遷移率的差別得到分離。 一般上層稱為濃縮層，下層稱為分離層。上層凝膠中溶質(zhì)以等速電泳的形式泳動，得到濃縮。,53,不連續(xù)凝膠電泳形式,不連續(xù)凝膠電泳的凝膠層由濃度不同的兩層凝膠組成。 上層凝膠濃度在2-3% Tg，其凝膠孔徑很大，凝膠對溶質(zhì)的泳動基本上無阻滯作用

19、，表現(xiàn)為等速泳動，溶質(zhì)在此層得到濃縮； 下層凝膠濃度在5-25% Tg ，凝膠具有一定的孔徑，各組分根據(jù)荷電量和遷移率的差別得到分離。 因此，上層稱為濃縮層或濃縮膠；下層稱為分離層或分離膠。,54,9.2 凝膠電泳,9.2.2.1 濃縮層內(nèi)的等速電泳 以陰離子型溶質(zhì)為例（溶質(zhì)向陽極移動）,55,等速電泳的原理,在上層凝膠層中，以遷移率最大的陰離子為前導離子（一般為強電解質(zhì)離子，Cl-）； 遷移率最小的陰離子為末尾離子（一般為甘氨酸）； 電泳開始前，將含有目標蛋白質(zhì)的料液加入到前導離子和末尾離子之間； 料液區(qū)的pH值高于前導離子區(qū)的pH值；,56,在前導離子區(qū)，前導離子的濃度與反離子的濃度一定時

20、，由于pH值不變，其泳動速度為一定值； 末尾離子根據(jù)其處位置的pH值所產(chǎn)生的解離度和離子遷移率將向陽極（帶負電荷）或陰極（帶正電荷）移動；,57,等速電泳的原理(續(xù)),料液中移動速度最快的組分A（pH高）首先進入前導離子區(qū)，但由于前導離子區(qū)pH值較低，溶質(zhì)的 解離度減小（所帶負電荷變少，pH降低），泳動速度減慢。 因此，其被排擠出前導離子區(qū)，從而在前導離子區(qū)和混合料液區(qū)交界處組分濃度增加；,58,同時，為了與反離子保持電中性，該處溶液pH值降低； 在此降低的pH值下，其它組分不能與組分A以相同的速度泳動而拖后； 隨著時間的推移，所有的溶質(zhì)都開始形成獨自的區(qū)帶，顯示與該區(qū)帶內(nèi)的弱酸離子和反離子濃

21、度相應的pH值。,59,等速電泳的特點,各個組分間形成相互連接的獨自區(qū)帶，顯示各自與對離子相應的pH值； 提高前導離子的濃度可以使溶質(zhì)得到濃縮； 采用適當?shù)牡头肿觾尚噪娊赓|(zhì)，在目標蛋白質(zhì)前后作間隔物，可使目標蛋白與其它蛋白質(zhì)完全分離；,60,等速電泳作為獨立的電泳法主要用于成分分析，在物質(zhì)回收方面應用極少。 主要是由于每個區(qū)帶互相連接，回收困難。 使用小分子間隔物雖然能解決這個問題但價格便宜、并且適合于用作間隔物的電解質(zhì)很難找到。 此外電泳裝置的散熱也是難于解決的工程設計問題,61,不連續(xù)凝膠的分離操作,不連續(xù)凝膠層的上部和下部分別使用pH值不同的緩沖液，其中上部緩沖液根據(jù)待分離蛋白質(zhì)等電點選

22、定。 上層濃縮層采用pH 6.8的緩沖液，下層分離層采用pH 8.3的緩沖液； 上層中，料液中蛋白質(zhì)夾在前導離子和末尾離子之間在濃縮層內(nèi)等速泳動，達到等速電泳狀態(tài)后進入下層分離凝膠； 下層中蛋白質(zhì)受到高濃度凝膠的分子篩作用，末尾離子會超過蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)依據(jù)荷電量和分子大小分離；,62,影響不連續(xù)凝膠分離的因素,緩沖液的pH值、組成 調(diào)節(jié)pH值可以改變荷電量Z； 分離膠的濃度或交聯(lián)度 調(diào)節(jié)凝膠濃度可改變遷移率； 外加電壓：改變 泳動速度,63,9.2 凝膠電泳,9.2.2.2 不連續(xù)凝膠電泳的數(shù)學模型 濃縮層（等速電泳） 擴散影響可以忽略不計，用平推流模型表示等速電泳過程 電場強度 電導率,64

23、,9.2 凝膠電泳,9.2.2.2 不連續(xù)凝膠電泳的數(shù)學模型 分離層 用軸向擴散模型表示分離層內(nèi)的分離過程 初始和邊界條件 分析解,65,9.2 凝膠電泳,9.2.2.3 分離操作及其特性 調(diào)節(jié)pH值可以改變荷電量，調(diào)節(jié)凝膠濃度可以改變遷移率，調(diào)節(jié)電壓可以改變泳動速度等 蛋白質(zhì)分離程度的參數(shù) 重疊度,66,等電點聚焦學習要點,理解：等電點聚焦的原理及特點,67,9.3等電聚焦電泳 isoelectric focusing electrophoresis,等電聚焦（isoelectrofocusing）, IEF 利用蛋白質(zhì)分子或其它兩性分子的等電點不同，在一個穩(wěn)定的、連續(xù)的、線性的pH梯度中進

24、行蛋白質(zhì)的分離和分析。 利用等電聚焦技術分離、分析的對象僅限于蛋白質(zhì)和兩性分子。 根據(jù)建立pH梯度的原理不同，梯度有分為載體兩性電解質(zhì)梯度（Carrier ampholytes pH gradient）和固相梯度。,68,等電聚焦電泳 利用聚丙烯酰胺凝膠內(nèi)的緩沖液在電場作用下沿電場方向在凝膠內(nèi)制造一個pH梯度。 每種蛋白質(zhì)都將遷移至與它的pI 相一致的pH處。,69,等電聚焦電泳進行過程中,等電聚焦電泳結束后,（）,（）,（）,（）,高pH,高pH,低pH,低pH,70,工作原理,蛋白質(zhì)的等電點 蛋白質(zhì)最主要的特性是它的帶電行為，它們在不同的pH環(huán)境中帶不同數(shù)量的正電或負電，只是在某一pH時，

25、蛋白質(zhì)的凈電荷為0，此pH即為該蛋白的等電點（isoelectric point pI）。 蛋白質(zhì)的等電點取決于它的氨基酸組成和構象，是一個物理化學常數(shù)。 可以利用等電點差異來進行蛋白質(zhì)的分離、分析,71,載體兩性電解質(zhì)pH梯度等電聚焦原理,載體兩性電解質(zhì)pH梯度等電聚焦是在支持介質(zhì)中加入載體兩性電解質(zhì)，通以直流電后在兩極之間形成穩(wěn)定、連續(xù)和線性的pH梯度，當帶電的蛋白質(zhì)分子進入該體系時，便會產(chǎn)生移動，并聚集于相當于其等電點的位置。,72,等電聚焦分離示意圖,73,常規(guī)PAGE和等電聚焦電泳的區(qū)別,74,載體兩性電解質(zhì)和pH梯度的形成,等電聚焦技術的關鍵在于pH梯度的建立 作為載體兩性電解質(zhì)應

26、該具有以下特點： 應該是兩性的，使它們在分離柱中也能達到一個平衡位置； 應該可以作為“載體”，兩性電解質(zhì)不能用于等電聚焦，只有載體兩性電解質(zhì)，即具有好的導電性和好的緩沖能力的化合物才能用于等電聚焦。,75,用于等電聚焦的主要載體兩性電解質(zhì),Ampholine(瑞典LKB公司) 由許多脂肪族的 多氨基多羧基 的異構體和同系物組成，它們具有連續(xù)改變的氨基與羧基比 Servalyte (德國Serva 公司) 產(chǎn)品Biolyte Pharmalyte (瑞典Pharmacia 公司) 產(chǎn)品分為九種pH范圍,76,pH梯度的形成,在沒有電場時，載體兩性電解質(zhì)的pH值大約是該溶液pH范圍的平均值，所有載

27、體兩性電解質(zhì)分子都荷電。 當引入電場時，載體兩性電解質(zhì)分子將向陰極或陽極遷移，帶有最低等電點的分子（荷最多負電）將最快地向陽極移動；當它達到凈電荷為0的位置時才停止，這個位置靠近陽極，由于它具有高的緩沖能力，使環(huán)境溶液的pH等于分子本身的pI。,77,其次，一些低pI的載體兩性電解質(zhì)（荷其次多的負電）也向陽極移動，直到它的凈電荷減少到0才停止。同樣的，其周圍環(huán)境溶液pH值也等于它本身的pI。 依次類推，所有的載體兩性電解質(zhì)分子用增加pI級數(shù)的方法將分別在陽極、陰極之間到達它們自己的位置，從而給出一個pH梯度。,78,載體兩性電解質(zhì)在電場中形成pH梯度的模式圖,79,水平等電聚焦電泳,制膠：溶液

28、配制（丙烯酰胺、N，N-甲叉雙丙烯酰胺、載體兩性電解質(zhì)等），灌膠； 電泳：加樣可在凝膠上的任何位置，濃度一般為0.52mg/ml； 固定： 染色： 脫色：,80,81,二維電泳學習要點,理解：上述電泳原理和特點 應用：了解上述電泳技術的適用范圍,82,二維電泳定義,二維電泳是同時利用分子的大小和等電點這兩種特性的差別進行蛋白質(zhì)等生物大分子的電泳分離方法。,83,二維電泳原理,在凝膠電泳槽的y方向上具有濃度分布，而在x方向上首先調(diào)配pH值梯度，使溶質(zhì)分子以等電點聚焦的形式泳動到其等電點處。 然后將適當pH值的緩沖液滲透到凝膠中，在y方向上加電場使溶質(zhì)再次泳動。此時溶質(zhì)之間的泳動速度受荷電量及分子

29、量的影響，直至泳動到被高濃度凝膠所阻滯，相互之間得到進一步分離。,二維電泳凝膠電泳等電點聚焦,84,二維電泳特點,分離度高，可分離等電點相差0.01個pH值的蛋白質(zhì)； 處理量小，適用于分離微量的高純度目標產(chǎn)物，用于科學研究；,85,86,87,逆向色譜電泳CACE結合了凝膠電泳的高分辨率和液相色譜的大處理能力，成為一種新型高效的蛋白質(zhì)分離與純化方法,9.5 逆向作用色譜電泳（自學）,88,在CACE過程中(圖1)， I區(qū)凝膠顆粒內(nèi)孔隙度小，蛋白質(zhì)能滲入的體積小，為排阻區(qū)；11區(qū)凝膠顆粒內(nèi)孔隙度大，蛋白質(zhì)能滲入的體積大，為滲入?yún)^(qū)蛋白質(zhì)隨載液流過分離柱時， I區(qū)內(nèi)流速大于區(qū)內(nèi)流速調(diào)節(jié)直流電場強度，

30、使目標蛋白質(zhì)逆向電泳速度介于兩區(qū)流速之間， 目標蛋白質(zhì)就在兩區(qū)交界面處富集交界面處蛋白質(zhì)濃度增加，導致平衡離子濃度增加，電導增加，電場強度下降，電泳速度下降，使目標蛋白質(zhì)運動速度為零,結果加入分離柱內(nèi)的目標蛋白質(zhì)富集在交界面，并隨加入量的增加向 區(qū)發(fā)展,9.5 逆向作用色譜電泳,89,9.5 逆向作用色譜電泳,90,CACE利用色譜速度的梯度變化實現(xiàn)溶質(zhì)在電場中的聚焦，集色譜柱容量大和電泳 分辨率高的特點與于一體，可用于間歇和連續(xù)分離過程，具有很大應用潛力。為實現(xiàn)連續(xù)操作和滿足在線檢測的需要，在分離柱中設置不含凝膠的富集區(qū)，使目標蛋白質(zhì)在此區(qū)域內(nèi)連續(xù)富集,9.5 逆向作用色譜電泳,91,CAC

31、E不僅限于利用不同的凝膠過濾介質(zhì)實現(xiàn)色譜速度的梯度變化，也可利用其他色譜介質(zhì)（如離子交換、疏水作用等），或可利用其他作用力和方法實現(xiàn)溶質(zhì)移動速度的梯度變化。例如梯度改變柱的直徑可實現(xiàn)流動相流速即色譜速度的梯度變化；利用密度梯度可實現(xiàn)沉降速度的梯度變化；利用磁場替代電場看進行逆向足以色譜磁泳等。 CACE具有高分辨率、容量大的優(yōu)點，但由于蛋白質(zhì)的電泳遷移率較低，為提高電泳速度，必須在高電壓下操作，產(chǎn)生的熱量高。因此，為便于設備冷卻，所用柱徑很細，在一定程度上影響了CACE的分離能力。,9.5 逆向作用色譜電泳,92,9.6.1 分離裝置 毛細管電泳和毛細管電色譜均利用毛細管 為電泳裝置。 毛細管

32、電泳是基于電泳的差速分離方法； 毛細管電色譜是電滲流驅(qū)動的色譜分離方法，電泳在分離過程中也會發(fā)揮一定的作用。,9.6 毛細管電泳和電色譜,93,9.6.1 分離裝置 傳統(tǒng)電泳分析：操作煩瑣，分離效率低，定量困難，無法與其他分析相比。 1981年，Jorgenson和Luckas，用75m內(nèi)徑石英毛細管進行電泳分析，柱效高達40萬/m，促進電泳技術發(fā)生了根本變革，迅速發(fā)展成為可與GC、HPLC相媲美的嶄新的分離分析技術高效毛細管電泳。,9.6 毛細管電泳和電色譜,94,毛細管材料主要有熔融石英、聚乙烯和聚四氟乙烯等。其中以石英毛細管的傳熱性最佳，應用最多。石英毛細管外壁涂有聚酰亞胺層，以提高毛細

33、管的彈性，防止脆裂。,9.6 毛細管電泳和電色譜,毛細管結構,毛細管是CE分離的心臟。理想的毛細管必須是電絕緣、紫外/可見光透明且富有彈性的，目前可以使用的有玻璃、熔融石英或聚四氟乙烯塑料等。 毛細管內(nèi)徑一般為10100m，其截面結構圖標意圖如圖17.23所示。,高效毛細管電泳儀high performance capillary electrophoresis apparatus,儀器,儀器流程與主要部件 process and main assembly,電壓：030kV； 分離柱不涂敷任何固定液； 紫外或激光誘導熒光檢測器； （可檢測到：10-1910-21 mol/L）,高壓電源,（1

34、）030 kV 穩(wěn)定、連續(xù)可調(diào)的直流電源； （2）具有恒壓、恒流、恒功率輸出； （3）電場強度程序控制系統(tǒng)； （4）電壓穩(wěn)定性：0.1%； （5）電源極性易轉(zhuǎn)換；,2. 毛細管柱 （1）材料：石英：各項性能好；玻璃：光學、機械性能差； （2）規(guī)格：內(nèi)徑2075m，外徑350400m；長度=1m,100,紫外吸收,緩沖液池,化學惰性，機械穩(wěn)定性好； 檢測器 要求：具有極高靈敏度，可柱端檢測； 檢測器、數(shù)據(jù)采集與計算機數(shù)據(jù)處理一體化；,類型 檢測限/mol 特點 紫外-可見 10-1310-15 加二極管陣列，光譜信息 熒光 10-1510-17 靈敏度高，樣品需衍生 激光誘導熒光 10-1810

35、-20 靈敏度極高，樣品需衍生 電導 10-1810-19 離子靈敏，需專用的裝置；,102,9.6.2 分離原理 在電場中，毛細管內(nèi)的電解質(zhì) 因其荷電性質(zhì)而發(fā)生電泳，同時在水溶液中，石英毛細管內(nèi)表面的硅羥基解離而帶負電荷，誘導管內(nèi)產(chǎn)生電滲流。 電泳過程中，溶質(zhì)的移動速度是電滲流和電泳的綜合結果。,9.6 毛細管電泳和電色譜,電滲現(xiàn)象與電滲流 electroosmosis and electroosmotic flow,當固體與液體接觸時，固體表面由于某種原因帶一種電荷，則因靜電引力使其周圍液體帶有相反電荷，在液-固界面形成雙電層，二者之間存在電位差。,當液體兩端施加電壓時，就會發(fā)生液體相對于固體表面的移動，這種液體相對于固體表面的移動的現(xiàn)象叫電滲現(xiàn)象。 電滲現(xiàn)象中整體移動著的液體叫電滲流（electroosmotic flow ，簡稱EOF）。,HPCE中的電滲現(xiàn)象與電滲流,石英毛細管柱，內(nèi)充液pH3時，表面電離成-SiO-,管內(nèi)壁帶負電荷，形成雙電層。,在高電場的作用下，帶正電荷的溶液表面及擴散層向陰極移動，由于這些陽離子實際上是溶劑化的，故將引起柱中的溶液整體向負極移動，速度電滲流。,HPCE中電滲流的大小與方向,電滲流的大小用電滲流速度電滲流表示，取決于電滲淌度和電場強度E。即 電滲流