生物化學(xué)課件07

1、第七章 蛋白質(zhì)的分離、純化與表征,一、蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì),二、蛋白質(zhì)分子的大小與形狀,三、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀,六、蛋白質(zhì)的含量測定與純度鑒定,四、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則,五、蛋白質(zhì)的分離純化方法,一、蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì),蛋白質(zhì)是一類兩性電解質(zhì)，能與酸或堿發(fā)生作用。在蛋白質(zhì)分子中，可解離基團(tuán)主要是側(cè)鏈基團(tuán)，及少數(shù)N端-NH2和C端-COOH。,天然球狀蛋白質(zhì)的可解離基團(tuán)大部分可被滴定，而某些天然蛋白質(zhì)中有一部分可解離基團(tuán)由于埋藏在分子內(nèi)部或參與氫鍵形成而不能解離。 等電點(diǎn)：在某一pH，它所帶的正電荷與負(fù)電荷相等。蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和它所含的酸性氨基酸殘基和堿性氨基酸殘基的比例有關(guān)。 等離子

2、點(diǎn)：沒有其它鹽類干擾時(shí)，蛋白質(zhì)質(zhì)子供體解離出的質(zhì)子數(shù)與質(zhì)子受體結(jié)合的質(zhì)子數(shù)相等時(shí)的pH值稱等離子點(diǎn)，是每種蛋白質(zhì)的特征常數(shù)。,二、蛋白質(zhì)分子的大小與形狀,（一）根據(jù)化學(xué)組成測定最低相對(duì)分子量,如Mb含鐵量為0.335%，其最低相對(duì)分子質(zhì)量為：,Mb最低相對(duì)分子質(zhì)量,鐵的原子量,鐵的百分含量,100,55.8/0.335 10016700,Hb最低相對(duì)分子質(zhì)量167004,牛血清白蛋白含Trp0.58% 最低Mr=35200，實(shí)際為69000，含2個(gè)Trp,（二）滲透壓法測定相對(duì)分子量,用半透膜將蛋白質(zhì)溶液與純水隔開，當(dāng)滲透達(dá)平衡時(shí)，測定其滲透壓，計(jì)算分子量：,C：濃度（g/m3） R：氣體常數(shù)

3、（8.314J/(Kmol) T：絕對(duì)溫度（K） ：以大氣壓表示的滲透壓(N/m2),（三）蛋白質(zhì)的擴(kuò)散和擴(kuò)散系數(shù),擴(kuò)散：由于濃度差引起的溶質(zhì)分子的凈遷移。擴(kuò)散的熱力學(xué)驅(qū)動(dòng)力是熵的增加。 擴(kuò)散系數(shù)D：等于當(dāng)濃度梯度為一個(gè)單位時(shí)，在一秒鐘內(nèi)通過1cm2面積所擴(kuò)散的溶質(zhì)量。 擴(kuò)散系數(shù)隨Mr的增加而降低，但對(duì)Mr的變化不敏感。對(duì)球形的大分子來說，擴(kuò)散系數(shù)與Mr的立方根成反比。,（四）沉降分析法測定相對(duì)分子量,1.沉降速率法,2.沉降平衡法,（五）凝膠過濾法測定蛋白質(zhì)相對(duì)分子量,（六）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定相對(duì)分子量,三、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀,（一）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì),蛋白質(zhì)分子直徑在

4、1-100nm之間，在水溶液中具有膠體溶液的通性（布朗運(yùn)動(dòng)，丁達(dá)爾現(xiàn)象，不能通過半透膜）。,透析：將含小分子雜質(zhì)的蛋白質(zhì)放入透析袋中，置水溶液中，小分子雜質(zhì)不斷從袋中出來，大分子蛋白質(zhì)仍留在袋中。,蛋白質(zhì)在水中溶解度依賴于多肽鏈氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的相對(duì)極性，離子化基團(tuán)數(shù)量越多，溶解度越大。 穩(wěn)定蛋白質(zhì)膠體溶液的主要因素蛋白質(zhì)表面極性基團(tuán)形成的水化膜將蛋白質(zhì)顆粒彼此隔開，不會(huì)互相碰撞凝聚而沉淀。兩性電解質(zhì)非等電狀態(tài)時(shí)，帶同種電荷，互相排斥不致聚集而沉淀。 一旦電荷被中和或水化膜被破壞，蛋白質(zhì)顆粒聚集，便從溶液中析出沉淀。,（二）蛋白質(zhì)的沉淀,鹽析法向蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽（NH4）2SO4

5、、Na2SO4、NaCl，使蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀。 有機(jī)溶劑沉淀法破壞水化膜，降低介電常數(shù)。 重金屬鹽沉淀 pH大于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，可與重金屬離子（Hg2+.Pb2+.Cu2+等）結(jié)成不溶性沉淀 生物堿試劑和某些酸類沉淀法 pH小于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)帶正電荷，易與生物堿試劑和酸類的負(fù)離子生成不溶性沉淀。生物堿試劑：是指能引起生物堿沉淀的一類試劑，單寧酸、苦味酸、鎢酸。酸類：三氯乙酸、磺基水楊酸。 加熱變性沉淀 往往是不可逆的。,四、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則,純化的實(shí)質(zhì)：增加制品(preparation)的純度或比活性。 蛋白與非蛋白分開，蛋白質(zhì)之間分開 一般程序：前處理、粗分級(jí)、

6、細(xì)分級(jí)、濃縮與保存,1、前處理： 將組織和細(xì)胞破碎 動(dòng)物組織和細(xì)胞：電動(dòng)搗碎機(jī)（waring blender) 勻漿器（homogenizer) 超聲波處理（ultrasonication) 植物組織和細(xì)胞：石英砂+提取液，研磨 纖維素酶處理 細(xì)菌： 超聲波震蕩、與砂研磨、高壓擠壓、溶菌 酶處理（分解肽聚糖） 差速離心法收集細(xì)胞的某一組分（differential centrifugation)： 在不同離心力下沉降的細(xì)胞組分 如果提取膜蛋白： 超聲波或去污劑使膜解聚，然后用適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)提取。,2、粗分級(jí)（rough fractionation) 一般用選擇性沉淀法。 （NH4）2SO4分級(jí)沉淀

7、法（鹽析） 等電點(diǎn)選擇性沉淀法 有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀法 熱處理選擇性沉淀法 生物堿或三氯乙酸選擇性沉淀法 3、細(xì)分級(jí)（fine fractionation) 透析除鹽 sephdex G-25凝膠過濾除鹽 層析法：凝膠過濾層析、離子交換層析、吸附層析、親和層析、疏水層析（反相HPLC） 電泳法：自由界面電泳、區(qū)帶電泳（凝膠電泳、濾紙和薄膜電泳、粉末電泳、細(xì)絲電泳等）、盤狀電泳、等電聚焦、雙向電泳 密度梯度離心,4、濃縮與保存 濃縮方法： 保存方法： 晶體保存： 結(jié)晶過程本身也伴隨著一定程度的提純。能否結(jié)晶不僅是純度 的一個(gè)指標(biāo)，也是判斷制品是否有活性的指標(biāo)。純度越高，溶液越濃，越容易結(jié)晶。 結(jié)晶方

8、法：使溶液略處于過飽和狀態(tài)。降低溫度、鹽析、加有機(jī)溶劑、調(diào)節(jié)pH、接入晶種。 凍干粉保存： 溶液保存： 加入抗凍劑（50%甘油）后-20-70保存。,五、蛋白質(zhì)的分離純化方法,（一）根據(jù)分子大小不同的純化方法,1.透析和超濾,透析：半透膜阻留蛋白質(zhì)分子，而讓小的溶質(zhì)分子和水通過，以除去蛋白質(zhì)溶液中小分子（鹽、低分子酸等）。,超濾：施以一定的壓力使小分子溶質(zhì)通過半透膜，而按半透膜的篩孔大小截留相應(yīng)的蛋白質(zhì)分子,沉降的速度與顆粒的重量、密度和形狀有關(guān)。離心后按其沉降的速度不同，彼此分開形成區(qū)帶。再進(jìn)行光學(xué)定位，針刺或冰凍切片采樣分析。,2.密度梯度（區(qū)帶）離心,蔗糖密度梯度 聚蔗糖密度梯度,3.凝

9、膠過濾,交聯(lián)葡聚糖（Sephadex）;聚丙烯酰胺凝膠（Bio-Gel P ）；瓊脂糖凝膠（Sepharose，Bio-Gel A）,交聯(lián)葡聚糖（Sephadex）,（二）利用溶解度差別的純化方法,1.等電點(diǎn)沉淀和pH控制,在等電點(diǎn)條件下，蛋白質(zhì)的電導(dǎo)性、溶解度最小，粘度最大。 在pI時(shí)，分子電荷為零，蛋白質(zhì)分子間的靜電排斥消失，從而蛋白質(zhì)出現(xiàn)聚集沉淀。,2.蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析,鹽溶：低鹽濃度時(shí)，蛋白質(zhì)溶解度增加。 鹽析：高鹽濃度時(shí)，使蛋白質(zhì)溶解度降低析出。 鹽析多用溶解度大的中性鹽，如(NH4)2SO4、NaCl、MgCl2、NH4Cl、KCl等的飽和溶液。,3.有機(jī)溶劑分級(jí)分離法,與水互溶

10、的有機(jī)溶劑(如甲醇、乙醇和丙酮等)能使蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降低。在室溫下，這些有機(jī)溶劑不僅能引起蛋白質(zhì)沉淀，而且伴隨者變性。 在一定溫度、pH和離子強(qiáng)度條件下，引進(jìn)蛋白質(zhì)沉淀的有機(jī)溶劑的濃度不同，因此控制有機(jī)溶劑濃度也可以分離蛋白質(zhì)。 有機(jī)溶劑引起蛋白質(zhì)沉淀的主要原因之一是改變介質(zhì)的介電常數(shù)；另一重要方式可能與鹽析相似，與蛋白質(zhì)爭奪水化水，致使蛋白質(zhì)聚集體的形成并沉淀。 水溶性非離子聚合物如聚乙二醇（PEG）也能引起蛋白質(zhì)沉淀。聚乙二醇的主要作用可能是脫去蛋白質(zhì)的水化層。聚乙二醇與蛋白質(zhì)親水基團(tuán)發(fā)生相互作用并在空間上阻礙蛋白質(zhì)與水相接近。蛋白質(zhì)在聚乙二醇中的溶解度明顯地依賴于聚乙二醇的分子

11、量。,4.溫度對(duì)蛋白質(zhì)溶解度的影響,在一定的溫度范圍內(nèi)，大部分球狀蛋白質(zhì)的溶解度隨溫度升高而增加。 大多數(shù)蛋白質(zhì)在低溫下比較穩(wěn)定，因此蛋白質(zhì)的分級(jí)分離操作一般都在0或更低的溫度下進(jìn)行。,（三）根據(jù)電荷不同的純化方法,1.電泳,在外電場的作用下，帶電顆粒，例如不處于等電狀態(tài)的蛋白質(zhì)分子，將向著與其電性相反的電極移動(dòng)，這種現(xiàn)象稱電泳(electrophoresis)或離子泳(ionphoresis)。 電泳不僅是分離蛋白質(zhì)混合物和鑒定蛋白質(zhì)純度的重要于段，而且也是研究蛋白質(zhì)性質(zhì)很有用的一種物理化學(xué)方法。,普通電泳、等電聚焦、雙向電泳、脈沖電泳、毛細(xì)管電泳 從電泳結(jié)果分：自由界面電泳、區(qū)帶電泳、盤狀

12、電泳 從裝置上分： 圓盤電泳（柱狀）、水平板電泳、垂直板電泳。 從支持物分： 自由界面電泳、紙電泳（或薄膜電泳）、凝膠電 泳（PAGE ，瓊脂糖膠，淀粉膠等）,2.聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）,3.毛細(xì)管電泳,4.等電聚焦電泳,等電聚焦電泳法測定蛋白質(zhì)pI,5.SDS-PAGE,6.離子交換層析,離子交換纖維素： 離子交換交聯(lián)葡聚糖：兼有分子篩效應(yīng) 離子交換交聯(lián)瓊脂糖：,（四）利用選擇性吸附的純化方法,極性：硅膠、氧化鋁、巖藻土（離子吸引和氫鍵） 非極性：活性炭（范德華力、疏水作用） 最廣泛最有效：羥基磷灰石（hydroxyapatite)，即結(jié)晶磷酸鈣Ca10（PO4）6（OH）2，可分離

13、蛋白質(zhì)、核酸，與DNA的親和力最高 層析介質(zhì)：苯基瓊脂糖（phenyl-sephadex) 辛基瓊脂糖(octa-sephadex) 洗脫： 低鹽高pH 非離子型去污劑（triton x-100) 脂肪醇（丁醇、乙二醇）,（五）利用對(duì)配體的特異生物學(xué)親和力的純化方法,配基： 酶的底物、輔酶、抑制劑、效應(yīng)物及其結(jié)構(gòu)類似物，激素與受體蛋白，抗原與抗體，生物素與親和素（抗親和素蛋白），凝集素。 免疫親和層析 凝集素親和層析 金屬螯和層析 染料配體層析,六、蛋白質(zhì)的含量測定與純度鑒定,（一）蛋白質(zhì)含量測定,總蛋白含量分析： 凱氏定氮法、Folin-酚法（Lowry法）、雙縮脲法、考馬斯亮藍(lán)法、紫外吸收法。 特定蛋白組分的含量分析： 酶和激素等：酶活性或激素活性表示（比活性） 其它蛋白：抗原抗體反應(yīng)(western blot),（二）純度鑒定（均一性）,基本手段：電泳分析：單條帶。 N端測定：1種N端