致畸試驗(yàn)#優(yōu)選資料

1、第七節(jié) 致畸試驗(yàn) 掌握致畸試驗(yàn)的內(nèi)容。 致畸試驗(yàn)（teratogenic test)：是鑒定動(dòng)物致畸物的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)法，下述的致畸試驗(yàn)方案用以檢測(cè)藥物的致畸性，也能得到有關(guān)藥物致胚胎死亡及生長遲緩的資料。 一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 理想的致畸實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)藥物的代謝過程應(yīng)與人相近，胎盤結(jié)構(gòu)亦相似，產(chǎn)仔多、孕期短、價(jià)廉、來源易及操作方便。在代謝功能與解剖結(jié)構(gòu)方面，比較符合要求的動(dòng)物是狗和猴；符合經(jīng)濟(jì)實(shí)用要求的是兔、大鼠、小鼠及豚鼠。但小動(dòng)物有不足之外，如兔自發(fā)畸形率較高，有時(shí)孕期長短不定（32-36天），大鼠對(duì)致畸作用有較大耐受性；小鼠對(duì)致畸反應(yīng)介于兔與大鼠之間，自發(fā)畸形略高于大鼠；豚鼠胎盤結(jié)構(gòu)與人相近，但孕期長（

2、6O天左右）產(chǎn)仔少（4只）。 常用大鼠，小鼠和兔。特別是大鼠，因?yàn)榇笫笞园l(fā)畸形率低，胎鼠大小也適于檢查。雌性動(dòng)物宜用成年末懷過孕的動(dòng)物。 動(dòng)物選擇要求對(duì)藥物敏感性高，而自發(fā)畸變形率低，至少采用兩種動(dòng)物，一種嚙齒類，另一種要求非嚙齒類。 二、動(dòng)物受孕及檢查方法 以大鼠為例，選用鼠齡三個(gè)月以上，體重200-250g雌鼠，飼養(yǎng)數(shù)天后作陰道分泌物涂片檢查，以判斷是否處于動(dòng)情期。如涂片見有較多白色分泌物，鏡檢發(fā)現(xiàn)有較多核上皮細(xì)胞，提示雌鼠處于動(dòng)情前期。大鼠性周期一般為4-5天，動(dòng)情前期向動(dòng)情期移行多在夜間。處于動(dòng)情前期的鼠按2:1或3:2比例與同齡雄鼠同籠過夜，次日檢查是否受孕。 檢查受孕方法有兩種。一

3、是檢查陰栓，陰栓是雄鼠精囊與凝固腺分泌液在雌鼠陰道凝結(jié)而成的白色塊狀物，形似米粒，大鼠的陰栓很易脫落，次日可于鼠籠下的糖瓷盤內(nèi)發(fā)現(xiàn)，小鼠的陰栓不易脫落，位置較深時(shí)用鑷子撐開陰道口方能看清。二是陰道涂片檢查精子，可用棉簽插人陰道轉(zhuǎn)動(dòng)數(shù)次后拔出，涂抹在滴有生理鹽水的玻片上，在低倍鏡下查找精子。 查到陰栓或精子即提示懷孕，檢出日為孕期的“0天”，次為第1天，以此推算孕齡。受孕率在春、秋季較高（可達(dá)70以上）夏、冬季較低(50%），所以也可采用人工控制溫度（23左右）及光線，讓雌雄動(dòng)物每天同籠6小時(shí)后作陰道涂片，以提高受孕率并便于在白夭工作。 三、劑量分組，給藥方式及時(shí)間 受試動(dòng)物分為4-5組，其中3

4、個(gè)劑量組（高、中、低），其余兩組為陽性對(duì)照和陰性對(duì)照組。高劑量組應(yīng)有母體毒性反應(yīng)，或?yàn)樽畲蠼o藥量。攝食量的減少，體重增長緩慢或下降，陰道出血，流血等均是毒性反應(yīng)的表現(xiàn)；低劑量組應(yīng)為母體和胚胎毒性反應(yīng)劑量。一般為臨床擬用劑量的某些倍量。中間劑量應(yīng)在高、低劑量組之間，劑量組間距應(yīng)為幾何級(jí)數(shù)，并能顯示微小的毒性差別。也可用LD50的1/3-1/5為高劑量組，低劑量組用1/30-1/100LD50，按等比差在高、低劑量組間插進(jìn)中間劑量，以期得出最小致畸劑量或最大無作用劑量。如已掌握或能估計(jì)人類實(shí)際接觸量，也可以人實(shí)際接觸量（或估計(jì)量）為低劑量組，并以其數(shù)倍（如10倍）為高劑量組。 陰性對(duì)照組為溶劑（賦

5、形劑）對(duì)照。陽性對(duì)照可用乙酞水楊酸(大鼠250mg/kg,小鼠150mg/kg),維生素A(濃魚肝油5m1/kg)。家兔可用6-氨基煙酰胺（2.5mg/kg）。已經(jīng)進(jìn)行過致畸試驗(yàn)，并確知所用的試驗(yàn)動(dòng)物對(duì)致畸物有陽性結(jié)果的實(shí)驗(yàn)室可略去陽性對(duì)照，每組受孕動(dòng)物數(shù)大鼠和小鼠15-20只，兔8-10只，狗和猴3-4只。 染毒途徑應(yīng)根據(jù)受試物的性質(zhì)及人類可能的接觸方式而定，一般多用灌胃和腹腔注射。染毒時(shí)間應(yīng)選擇胚胎對(duì)致畸物的易感期（器官形成期）。大、小鼠和兔進(jìn)行致畸試驗(yàn)的日程安排見。 每只試驗(yàn)動(dòng)物在試驗(yàn)期間都應(yīng)有準(zhǔn)確記錄受精日期，給予受試物日期和劑量，給藥后動(dòng)物的體重應(yīng)每隔3-4天稱一次（0,3,7,10

6、,13、16,20），并根據(jù)體重調(diào)整給藥劑量，另一方面也可對(duì)受試物動(dòng)物受精后懷孕與否及受試物對(duì)胚胎發(fā)育有無影響作出初步估計(jì)，如懷孕胚胎發(fā)育正常，則受試動(dòng)物的體重可明顯地持續(xù)增長；若胚胎中毒死亡或流產(chǎn)，母體體重則停止增長以至下降。 四、觀察 對(duì)母體的觀察：每天檢查有無中毒癥狀，對(duì)有流產(chǎn)或早產(chǎn)征兆者（如見陰道出血），及時(shí)處死檢查。 對(duì)胎仔的觀察：于分娩前1-2日處死受孕動(dòng)物，以防止自然分娩后母鼠吞食畸形仔鼠。剖腹取出子宮和卵巢，稱重辨認(rèn)子宮內(nèi)的活胎、死胎及吸收數(shù)，并從左側(cè)子宮角頂端開始直到右側(cè)子宮頂端，按順序編號(hào)記錄：然后檢查和記錄黃體數(shù)。 活胎：完整成形，肉紅色，看自然運(yùn)動(dòng)，對(duì)機(jī)械刺激有運(yùn)動(dòng)反應(yīng)

7、；胎盤紅色，較大。 晚死胎：完整成形，灰紅色，無自然運(yùn)動(dòng)，對(duì)機(jī)械刺激無反應(yīng)；胎盤灰紅色，較小。 早死胎：紫褐色，未完整成形，無自然運(yùn)動(dòng)，胎盤暗紫。 吸收胎：暗紫或淺色點(diǎn)塊，不能辨認(rèn)胚胎和胎盤。 黃體：在卵巢表面呈黃色魚子狀突起，提示孕鼠的排卵數(shù)。 活胎的外觀畸形并記錄的類型、部位及程度。將每只母鼠的2/3活胎剝?nèi)テつw和內(nèi)臟，經(jīng)茜素紅染色及脫水透明后，檢查骨骼畸形；余1/3活胎浸人鮑音氏(Bouin)固定液，供檢查內(nèi)臟畸形。常見的外觀、骨骼和內(nèi)臟見表18-6、表18-7、表18-8。由于目前沒有充分證據(jù)表明骨骼對(duì)致畸物比內(nèi)臟更敏感，因此，有人主張將來自兩個(gè)子宮角的胎鼠隨機(jī)分配到骨骼畸形檢查中。現(xiàn)

8、將胎仔的外部檢查及骨骼和內(nèi)臟畸形檢查的具體方法敘述如下： 胎仔外部檢查：將處死（或深度麻醉）的試驗(yàn)動(dòng)物剖腹暴露子宮，進(jìn)行下列的檢查和記錄。 確定懷孕情況、順序編號(hào)依次鑒別檢查活胎數(shù)，早期死胎數(shù)，晚期死胎數(shù)和吸收胎數(shù)。 剪開子宮，按編號(hào)順序，對(duì)胎仔逐一檢查記錄性別、體重、身長、尾長和全窩胎盤總量。 對(duì)活胎仔由頭部、軀干、四肢、尾部進(jìn)行外觀檢查，各部位常見的畸形見表18-6。 (2)胎仔的骨骼檢查：胎仔的骨骼檢查是致畸試驗(yàn)一項(xiàng)重要觀察內(nèi)容，一般是將每窩胎仔的1/2或2/3數(shù)量留作此項(xiàng)檢查。 其具體方法如下： 將留作骨骼檢查的胎仔放入75%-90%的乙醉溶液中進(jìn)行固定，時(shí)間2-5天。 固定好的胎仔置

9、于1%的氫氧化鉀溶液中3-10天，直至肌肉透明可見骨骼為止。在此期間依據(jù)情況可更換1%,氫氧化鉀溶液數(shù)次，每次更換溶液時(shí)將胎仔脫落的皮膚洗去。 經(jīng)1氫氧化鉀溶液處理后的胎仔，用茜素紅進(jìn)行染色直至骨骼染成桃紅色或紫色為止，一般需2-5天，必要時(shí)中間須更換新染色液數(shù)次。 茜素紅染色液的配制：將茜素紅加人下面混合液中至飽和為止。 冰醋酸 5m1 純甘油 10ml 1水合氯醛 60ml 使用時(shí)取上述茜素紅飽和溶液lml，加1%氫氧化鉀溶液至1000ml混合配成應(yīng)用液。 經(jīng)染色后的胎仔置于以下透明液中1-2天。若透明不夠滿意時(shí)，可適當(dāng)延長在透明液中的時(shí)間。 透明液I：甘油20分，2 %氫氧化鉀溶液3分，

10、蒸餾水77分。 透明液II：甘油50分，2%氫氧化鉀溶液3分，蒸餾水47分。 透明液III：甘油75分，蒸餾水25分。 經(jīng)上述處理的胎仔骨骼標(biāo)本，可在肉眼或放大鏡，解剖顯微鏡下觀察檢查。注意檢查各骨骼的狀態(tài)，大小，數(shù)量有無異常及骨化程度。 (3)胎仔的內(nèi)臟檢查：經(jīng)外觀檢查后的胎仔隨機(jī)法將胎仔數(shù)1/2或1/3置于鮑音(Bouin）氏液中 固定1-2周后，即可用徒手切片觀察方法進(jìn)行檢查，其具體方法如下： 頭部器官的檢查一通過以下切面來進(jìn)行觀察檢查。 戴橡皮手套取出固定好的胎仔標(biāo)本，在自來水下洗去固定液，用單面刀徒手沿口經(jīng)耳作一水平切面，這一切面將口腔上下愕分開，主要檢查有無愕裂，舌缺或分叉。 把上

11、述切面切下的顱頂部，沿眼球前沿垂直作額狀切面，這一切面著重檢查鼻道有無畸形，如鼻道擴(kuò)大、單鼻道等。 沿著眼球正中垂直作第二額狀切面，檢查眼球有無畸形，如少眼，小眼，無眼。檢查有無腦積水，有無腦室擴(kuò)大。 沿眼球后緣垂直作第三個(gè)額切面，檢查有無腦水腫積水，有無腦室擴(kuò)大。 胸腔、腹腔和盆腔檢查沿胸、腹壁中線和肋下緣水平線作“十”字切開胸腹，暴露胸腔、腹腔及盆腔內(nèi)的器官，然后逐一檢查各主要臟器的位置、數(shù)目、大小勻稱性及形狀等有無異常。 五、結(jié)果評(píng)定 主要計(jì)算畸胎總數(shù)和畸形總數(shù)。在計(jì)算畸胎總數(shù)時(shí)，每一活胎仔出現(xiàn)一種或一種以上畸形，均作為一個(gè)畸胎。計(jì)算畸形總數(shù)時(shí)，在同一活胎仔出現(xiàn)一種畸形，作為一個(gè)畸形計(jì)算

12、，如出現(xiàn)兩種或兩個(gè)畸形，即作為兩個(gè)畸形計(jì)算，并依此類推。計(jì)算畸胎總數(shù)和畸形總數(shù)的同時(shí)，必須考慮其有無劑量一效應(yīng)關(guān)系，更重要的是按下列指標(biāo)與對(duì)照組進(jìn)行比較： 1對(duì)各組母動(dòng)物需統(tǒng)計(jì)如下指標(biāo) 交配成功動(dòng)物及交配率。 死亡動(dòng)物數(shù)及死亡率。 剖檢母動(dòng)物的平均體重及孕期體重增長值或母體增重。 母體增重（g）處死時(shí)母體體重-妊娠第日體重-處死時(shí)子宮連胎重 母體畸胎出現(xiàn)率，主要根據(jù)出現(xiàn)畸胎的母體在妊娠母體總數(shù)中所占的百分率。計(jì)算出現(xiàn)畸形母體數(shù)時(shí)，同一母體不論出現(xiàn)多少畸形胎仔或多種畸形，一律按一個(gè)出現(xiàn)畸形胎仔的母體計(jì)算。 2對(duì)各組胎仔需統(tǒng)計(jì)如下指標(biāo) 平均活胎數(shù)及活胎率 吸收胎數(shù)和吸收胎率 死胎數(shù)和死胎率。 外觀

13、畸形率、骨骼畸形率、內(nèi)臟畸形率 3實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 不同指標(biāo)用不同的顯著性檢驗(yàn)方法處理。平均體重、平均黃體數(shù)、平均著床數(shù)、平均活胎數(shù)、平均活胎體重用t檢驗(yàn)：妊娠率、交配率、受孕率、活胎率、用2檢驗(yàn)；胎吸收率、死胎率、畸胎率用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)。可能時(shí)計(jì)算劑量一效應(yīng)關(guān)系。 根據(jù)上述指標(biāo)計(jì)算后，最后評(píng)定結(jié)果，確定此種受試物是否具有致畸作用，尚要注意下列間題： (1)致畸作用具有劑量與效應(yīng)關(guān)系，所以，對(duì)任何畸形的出現(xiàn)是否具有劑量一效應(yīng)關(guān)系應(yīng)該充分考慮更重要的是必須經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，肯定試驗(yàn)組出現(xiàn)致畸胎的母體顯著高于對(duì)照組，并且試驗(yàn)組動(dòng)物活胎仔出現(xiàn)的畸形率應(yīng)顯著高于對(duì)照組，才可考慮其致畸作用。

14、 (2)每個(gè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)掌握所用試驗(yàn)動(dòng)物長期以來的自然畸形發(fā)生情況，包括自然出現(xiàn)的畸形類型和頻率。試驗(yàn)組動(dòng)物出現(xiàn)的畸形，如長期以來在對(duì)照組動(dòng)物未曾出現(xiàn)過，則對(duì)受試物致畸作用，更應(yīng)認(rèn)真對(duì)待；反之，則應(yīng)慎重做出結(jié)論。 (3)生物體常有變異現(xiàn)象，變異是群體中個(gè)體間的差異。特別是同一物種內(nèi)一個(gè)體與另一些個(gè)體的差異。變異為基因所控制，具有適應(yīng)和進(jìn)化的意義，與外來化合物干擾胚胎正常生長發(fā)育所引起的畸形完全不同，有人認(rèn)為肋骨椎骨數(shù)目比正常多一個(gè)或少一個(gè)等現(xiàn)象皆屬于變異，不能做為致畸。但變異出現(xiàn)率一般較低，也不呈現(xiàn)劑量與效應(yīng)關(guān)系，借此可將兩者加以區(qū)別。 (4)致畸作用中存在種屬差異，而且同種動(dòng)物的品系間亦有差異。

15、因此，在一種動(dòng)物出現(xiàn)致畸作用后，最好在另一種動(dòng)物再進(jìn)行試驗(yàn)或至少在同種動(dòng)物再重復(fù)進(jìn)行試驗(yàn)。如結(jié)果一致，才可以認(rèn)為對(duì)動(dòng)物確有致畸作用。 由于致畸作用存在種屬差異，所以任何外來化合物對(duì)動(dòng)物具有致畸作用，不一定對(duì)人類致畸。一方面應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行人群流行病學(xué)調(diào)查，以確定其在人體的致畸作用；另一方面應(yīng)認(rèn)識(shí)致畸作用是外來化合物的毒性表現(xiàn)的一種。凡是對(duì)動(dòng)物具有致畸作用的化合物，也應(yīng)看作對(duì)人體致畸的可能，故應(yīng)采取各種措施，使人類盡量減少與其接觸，這一問題涉及動(dòng)物致畸試驗(yàn)結(jié)果推論到人的問題。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果推論到人的間題，目前在毒理學(xué)中極為重視面研究也極為活躍。雖然有人提出許多方法或途徑，但迄今為止，還沒有建立一個(gè)簡(jiǎn)單的方法，將動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果推算到人。致畸作用也是如此，絕對(duì)不能簡(jiǎn)單地將小鼠，大鼠或其它動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)結(jié)果直接應(yīng)用于人。現(xiàn)參考?xì)W洲經(jīng)濟(jì)共同體和經(jīng)濟(jì)合作開發(fā)組織所建議的致畸物分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，且加以綜合。注意其在實(shí)際工作中僅能做為參考，必須結(jié)合實(shí)際情況，分析思考，靈活運(yùn)用。 (6)將一種外來化合物對(duì)人類的致畸作用進(jìn)行最后評(píng)定，決定取舍時(shí)，應(yīng)該特別注意人類實(shí)際接觸劑量