《生物化學(xué)》教學(xué)課件：基因結(jié)構(gòu)分析策略-zhan-1-2

1、基因結(jié)構(gòu)分析的基本策略,Basic strategy for analyzing gene structure,主要內(nèi)容： 基因序列結(jié)構(gòu)的生物信息學(xué)檢索和比對(duì) 分析 基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的鑒定 啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)及功能分析 編碼序列結(jié)構(gòu)分析,第一節(jié) 基因序列結(jié)構(gòu)的生物信息學(xué)檢索和比對(duì)分析,就是在數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)基因序列或DNA序列進(jìn)行 比對(duì)分析，以其能夠推測(cè)出其結(jié)構(gòu)、功能及在進(jìn)化上的聯(lián)系。 比對(duì)方法： 1. 雙重比對(duì) 2. 多序列比對(duì),序列比對(duì)目的： 判斷兩個(gè)或多個(gè)序列間是否具有足夠的相似性 從而判斷二者之間是否具有同源性,直接的數(shù)量關(guān)系,進(jìn)化上曾具有共同祖先,基因或DNA序列比對(duì)分析,序列比對(duì)的結(jié)果： 取代

2、插入 缺失,Mouse: GGKDSCQGDSGGPVVCNG-QLQGVVSWGDGCAQKNKPGVYTKVYNYVKWIKNTIAAN Crayfish: GGKDSCQGDSGGPLAASDTGSTYLAGIVSWGYGCARPGYPGVYTEVSYHVDWIKANAV-,缺失？,保守序列,保守序列： 可能是共同進(jìn)化的標(biāo)志 可能并不代表功能的重要性,插入？,當(dāng)兩個(gè)序列非常相似時(shí)，是否一定說(shuō)明它們具有相似的功能？,NCBI數(shù)據(jù)庫(kù),NCBI首先創(chuàng)建GenBank數(shù)據(jù)庫(kù),于1991年開(kāi)發(fā)了Entrez數(shù)據(jù)庫(kù)檢索系統(tǒng)，該系統(tǒng)整合了GenBank、EMBL、PIR(Protein Informa

3、tion Resource )和SWISS-PROT等數(shù)據(jù)庫(kù)的序列信息以及MEDLINE有關(guān)序列的文獻(xiàn)信息，并通過(guò)相關(guān)鏈接，將他們有機(jī)地結(jié)合在一起; NCBI還提供了其他數(shù)據(jù)庫(kù)，包括在線人類孟德?tīng)栠z傳(OMIM）、三維蛋白結(jié)構(gòu)的分子模型數(shù)據(jù)庫(kù)（MMDB）、人類基因序列集成（UniGene）、人類基因組基因圖譜（GMHG）、生物門類（Toxonomy） 等數(shù)據(jù)庫(kù)。,1. 各種數(shù)據(jù)庫(kù)的介紹,(1) Nucleotide,該數(shù)據(jù)庫(kù)由國(guó)際核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)成員美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院GenBank、日本DNA數(shù)據(jù)庫(kù)(DDBJ)和歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)庫(kù)(EMBL）三部分?jǐn)?shù)據(jù)組成； 三個(gè)組織每天交換各自數(shù)據(jù)庫(kù)

4、中的新增序列實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)共享。,(2) Genome,即基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，提供了多種基因組、完全染色體、重疊序列圖譜以及一體化基因物理圖譜。,(3) Structures,即結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)或稱分子模型數(shù)據(jù)庫(kù)(MMDB)，包含來(lái)自X線晶體學(xué)和三維結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。,NCBI已經(jīng)將結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)交叉鏈接到書(shū)目信息、序列數(shù)據(jù)庫(kù)和NCBI的Taxonomy中運(yùn)用NCBI的3D結(jié)構(gòu)瀏覽器和Cn3D，可以很容易地從Entrez獲得分子的分子結(jié)構(gòu)間相互作用的圖像。,(4) Taxonomy,即生物學(xué)門類數(shù)據(jù)庫(kù)，可以按生物學(xué)門類進(jìn)行檢索或?yàn)g覽其核苷酸序列、蛋白質(zhì)序列、結(jié)構(gòu)等。,(5) PopSet,包含研究一個(gè)人群、一個(gè)種系發(fā)生

5、或描述人群變化的一組組聯(lián)合序列； PopSet既包含了核酸序列數(shù)據(jù)又包含了蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)。,(7) 文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù),PubMed：生物醫(yī)藥科學(xué)的檢索系統(tǒng) OMIM：孟德?tīng)栠z傳學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)是人類基因和基因疾病的目錄數(shù)據(jù)庫(kù) 其他：書(shū)目，雜志，文章引用匹配等,該數(shù)據(jù)庫(kù)包括原文信息、圖片和參考信息，同時(shí)還可以鏈接到Entrez系統(tǒng)MEDLINE數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)文獻(xiàn)和序列信息。,2. NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)檢索,在檢索框中輸入檢索詞，檢索詞間默認(rèn)邏輯關(guān)系為AND，檢索規(guī)則基本同PubMed,可以通過(guò)下拉菜單選擇記錄的顯示格式，通常選擇GenBank Report格式或FASTA Report格式。 當(dāng)選擇GenBank R

6、eport格式后，屏幕顯示較完整的基因記錄，包括：基因位點(diǎn)(Locus）、基因定義(Definition）、基因存取號(hào)(Accession）、 核酸編號(hào)(NID ）、關(guān)鍵詞(Keywords）、 來(lái)源(Source）、組織分類(Organism)、參考文獻(xiàn)(Reference)、 著者(Author）、題目(Title）、期刊(Journal）、Medline存取號(hào)(Medline）、序列特征(Features）、基因(Gene）、CDS（cDNA）、等位基因(Allele） 對(duì)等的肽(Mat-Peptide ）、計(jì)算堿基數(shù)(Base Count）、原序列(Origin）。 FASTA Rep

7、ort格式僅包括檢出序列的簡(jiǎn)要特征描述。,例如：人EPO基因序列檢索 (/genbank/),輸入關(guān)鍵詞，選擇合適的程序,向下拉尋找符合目標(biāo)的條目,點(diǎn)擊此條打開(kāi)連接,向下拉尋找關(guān)注的內(nèi)容,凡是連接的地方都可以點(diǎn)擊查看,可以直接拷貝保存相關(guān)內(nèi)容,Entrez： 是一個(gè)用以整合NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中信息的搜尋和檢索工具,3. NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)搜索工具,BLAST： 是一個(gè)NCBI開(kāi)發(fā)的序列相似搜索程序，還可作為鑒別基因和遺傳特點(diǎn)的手段,NCBI提供的附加軟件工具有：開(kāi)放閱讀框?qū)ひ捚鳎∣RF Finder），電子PCR，和序列提交工具，Sequin和Ban

8、kIt,Entrez的一個(gè)強(qiáng)大和獨(dú)特的特點(diǎn)是檢索相關(guān)的序列，結(jié)構(gòu)，和參考文獻(xiàn)的能力,Entrez:,BLAST(/BLAST/):,BLAST程序(Basic Local Alignment Search Tool ),點(diǎn)擊核酸序列blast，在框內(nèi)輸入序列：,選擇搜索條件：,選擇特殊程序：,比較兩個(gè)序列之間的相似性：,以上僅簡(jiǎn)介了NCBI相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)及工具軟件關(guān)于其他數(shù)據(jù)庫(kù)及軟件工具等信息見(jiàn)書(shū)中第二十五章表1-5。,第二節(jié) 基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的鑒定,主要內(nèi)容： 基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的序列特征 基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的序列分析,一、基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的序列特征,1.

9、 真核基因及其調(diào)控元件,II 型啟動(dòng)子的TSS： 沒(méi)有明確的保守序列 有一種趨勢(shì)，即mRNA 的第一個(gè)堿基是A，其側(cè)翼堿基傾向于是嘧啶 與mRNA第一個(gè)堿基對(duì)應(yīng)的位置標(biāo)記為-1區(qū) -3 +5區(qū)域被稱作起始子 (initiator),2. 轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)（TSS）,Py2CAPy5,二、基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的序列分析,思考： 轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn) (TSS)位于基因編碼序列的5端 基因編碼區(qū)是指編碼多肽鏈的核苷酸序列 多肽鏈?zhǔn)且詍RNA為模板經(jīng)翻譯合成的,因此，分析鑒定TSS的方法都是以cDNA為切入點(diǎn)。,1. cDNA克隆測(cè)序,AAAAAn,AAAAAn,mRNA,反轉(zhuǎn)錄酶,AAAAAn,Oligo (dT)15

10、-18,cDNA第一鏈,CCCCC,cDNA第一鏈,nCCCC,nGGGG,cDNA第二鏈,克隆擴(kuò)增，5端測(cè)序分析,反轉(zhuǎn)錄酶的末端轉(zhuǎn)移酶活性 Oligo (dG)15-18,mRNA,與線性載體相連接,要求： cDNA的5端完整無(wú)缺,2. cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(RACE),傳統(tǒng)的RACE (rapid amplification of cDNA ends) ：,mRNA,cDNA,mRNA,-5,3-,反轉(zhuǎn)錄酶,Oligo (dT)15-18,末端轉(zhuǎn)移酶,dGTP,nGGGGG,錨定PCR擴(kuò)增,nGGGGG,nCCCCC,錨定引物,特異引物,PCR產(chǎn)物,Deep-RACE：,用寡核苷酸替代

11、mRNA的5端帽結(jié)構(gòu)以及發(fā)光標(biāo)記巢氏PCR引物，能平行分析多個(gè)基因,并省卻了耗時(shí)的克隆步驟，實(shí)現(xiàn)高通量鑒定轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn) 。與常規(guī)的RACE PCR產(chǎn)物測(cè)序相比，它更為準(zhǔn)確和經(jīng)濟(jì)。,5-p 帽,mRNA,牛小腸磷酸酶 (CIP),5-帽,煙草酸焦磷酸酶 (TAP),5-,將5-RACE adaptor (寡核苷酸)加到脫帽RNA分子上,5-RACE adaptor (寡核苷酸),反轉(zhuǎn)錄酶 10nt 隨機(jī)引物,5-RACE adaptor,5-RACE adaptor,5-RACE adaptor,5-RACE adaptor,長(zhǎng)短不同的cDNA,隨機(jī)引物,用10nt隨機(jī)引物與5-RACE引物進(jìn)行P

12、CR擴(kuò)增,5-RACE adaptor,5-RACE adaptor,5-RACE adaptor,5-RACE adaptor,PCR產(chǎn)物,隨機(jī)引物,以5-RACE引物和5端甩尾的基因特異性反向引物進(jìn)行巢式PCR,5-RACE adaptor,以5-RACE發(fā)光標(biāo)記引物對(duì)PCR混合物直接進(jìn)行一次性測(cè)序,分析基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn),3. 連續(xù)分析基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn),在RACE的基礎(chǔ)上，通過(guò)在轉(zhuǎn)錄本5 端引入一個(gè)特殊的核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了基因5 端短片段串聯(lián)連接產(chǎn)物一次測(cè)序分析多個(gè)基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的目的。 主要有兩種方法： 5 端連續(xù)分析基因表達(dá)（5 -end serial analysis of ge

13、ne expression, 5 SAGE） 帽分析基因表達(dá)（cap analysis gene expression, CAGE）,(1) 5 SAGE,5SAGE是在PCR過(guò)程中將MmeI酶切位點(diǎn)引物cDNA的5端，通過(guò)酶切和連接獲得不同短片段重復(fù)序列，并對(duì)重復(fù)序列進(jìn)行測(cè)序獲得大量片段序列信息 ； 不同序列的短片段代表不同基因的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn) (TSS)。,MmeI: 是一種特殊的II型限制性核酸內(nèi)切酶 識(shí)別的序列不是回文結(jié)構(gòu)，而是不對(duì)稱的DNA序列5-TCCRAC-3（R代表G或A） 在識(shí)別位點(diǎn)下游1820堿基處切開(kāi)雙鏈DNA,Gppp,AAAAAAAAn,mRNA,用BAP和TAP處理,A

14、AAAAAAAn,p,在RNA的5端加上寡核苷酸帽,AAAAAAAAn,XhoI,MmeI,反轉(zhuǎn)錄酶,RT,AAAAAAAAn,cDNA,PCR,Biotin-標(biāo)記引物,隨機(jī)引物,Biotin,MmeI,酶切消化,20 mer,親和素,用親和素-生物素，可以將5-端片段與其他片段分離開(kāi),20 mer,連接,20 mer,PCR擴(kuò)增,XhoI,酶切消化,自身連接,串聯(lián)體,測(cè)序分析,(2) CAGE,CAGE與5SAGE非常相似 所不同的是: CAGE不需要在RNA上加接頭，而是用oligo(dT)引物先進(jìn)行第一鏈cDNA的合成 然后通過(guò)捕獲帽結(jié)構(gòu)，將含有MmeI和另一內(nèi)切酶位點(diǎn)如XmaJI的li

15、nker加到單鏈全長(zhǎng)cDNA的3末端,AAAAAAn,Cap,mRNA,反轉(zhuǎn)錄酶,Oligo (dT)1518,AAAAAAn,Cap,TTTTTTTn,cDNA,捕獲5-帽結(jié)構(gòu),單鏈linker,連接,TTTTTTTn,Biotin,cDNA第二鏈的合成,TTTTTTTn,AAAAAAn,MmeI,XmaJI,MmeI,酶切,親和素,20 mer,用親和素-生物素，可以將5-端片段與其他片段分離開(kāi),連接第二個(gè)linker,XbaI,XmaJI,XmaJI, Xbal,酶切消化,PCR（用linker1和linker2作引物）,Linker 1,Linker 2,純化，串聯(lián)連接，克隆,20 m

16、er,XmaJI和XbaI是同尾酶： XmaJI：CCTAGG XbaI： TCTAGA,串聯(lián)體,測(cè)序分析,第三節(jié) 啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)與功能分析,啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)分析 啟動(dòng)子的功能分析,主要內(nèi)容：,啟動(dòng)子（promoter）： 是一段能被蛋白質(zhì)識(shí)別的、參與特定基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的DNA序列； II型啟動(dòng)子通常位于結(jié)構(gòu)基因的上游； 共通序列(consensus sequence)是其特征性序列。,共通序列和啟動(dòng)子所處的位置是研究啟動(dòng)子的重要線索。,共通序列,例如： 原核基因的共通序列： -10區(qū)：Pribnow box（TATAAT序列） -35區(qū)：TTGACA 序列,TATAAT,TTGACA,真核基因的共通

17、序列： 真核基因啟動(dòng)子在-50區(qū)域附近（大約5%30%基因啟動(dòng)子在-25-30區(qū)域）有TATA box（TATAAA序列）,一、啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)分析,主要方法： 利用PCR技術(shù)克隆啟動(dòng)子 利用核酸-蛋白質(zhì)相互作用方法研究啟動(dòng)子 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)啟動(dòng)子,（一）利用PCR技術(shù)克隆啟動(dòng)子,特異性基因序列,基因上游序列,基因組DNA,根據(jù)基因序列合成一條反向引物 正向引物用隨機(jī)引物,PCR擴(kuò)增,隨機(jī)引物,特異引物,克隆及測(cè)序分析,注意： 真核基因有內(nèi)含子，應(yīng)該根據(jù)mRNA序列設(shè)計(jì)特異性引物 特異性引物盡可能靠近基因的5端,1. 根據(jù)已知基因序列直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增,2. 利用TSS釣取啟動(dòng)子,AAAAAAn,

18、Cap 5-,mRNA,反轉(zhuǎn)錄,AAAAAAn,TTTTTTn,cDNA,插入載體，克隆擴(kuò)增,Cap 5-,以基因特異引物與載體引物配對(duì),PCR擴(kuò)增,5-,測(cè)序分析基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)序列,以TSS序列為引物，基因組序列為模板，與隨機(jī)引物配對(duì)進(jìn)行TSS上游序列的PCR擴(kuò)增,3. 利用環(huán)狀PCR釣取啟動(dòng)子,基因組DNA,酶切消化,基因組DNA片段,直接環(huán)化連接,加上接頭后環(huán)化連接,根據(jù)基因上游序列設(shè)計(jì)一對(duì)反向互補(bǔ)引物,PCR擴(kuò)增,根據(jù)接頭序列設(shè)計(jì)引物,PCR擴(kuò)增,克隆 測(cè)序分析,克隆 測(cè)序分析,加接頭環(huán)化PCR不依賴特異基因序列 可用于篩選啟動(dòng)子,接頭,（二）利用核酸-蛋白質(zhì)互作方法研究啟動(dòng)子,啟動(dòng)子

19、是一段能被蛋白質(zhì)識(shí)別和結(jié)合的DNA序列，因此，能夠檢測(cè)核酸-蛋白質(zhì)相互作用的研究方法都可以用于啟動(dòng)子的研究中。,主要方法： 足跡法（酶足跡法，化學(xué)足跡法） 電泳遷移率變動(dòng)實(shí)驗(yàn)（EMSA） 染色體免疫沉淀（ChIP）,1. 用足跡法研究啟動(dòng)子,足跡法（Footprinting）：利用DNA電泳條帶連續(xù)性中斷的圖譜特點(diǎn)判斷與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA區(qū)域 。,基本流程：,DNA與蛋白質(zhì)相互作用,切割DNA,凝膠電泳,分析電泳圖譜,（1）酶足跡法 (Enzymatic footprinting),利用能切割DNA的酶處理DNA-蛋白質(zhì)混合物，然后通過(guò)電泳進(jìn)行分析 。,DNase I足跡法 ：,是一種利用DN

20、ase I 隨機(jī)切割雙鏈DNA，從而確定DNA結(jié)合蛋白在DNA上結(jié)合位點(diǎn)的方法 。,核酸外切酶III足跡法：,是利用核酸外切酶III（Exo III）的35外切酶活性從3末端切割雙鏈DNA的特性，確定蛋白質(zhì)在DNA上的結(jié)合位點(diǎn)的常用方法。,DNase I 足跡法,dsDNA,單鏈末端標(biāo)記,DNA結(jié)合蛋白,DNase I,酶切消化 （控制反應(yīng)時(shí)間）,產(chǎn)生長(zhǎng)短不同的片段 但蛋白質(zhì)結(jié)合區(qū)被保護(hù),蛋白質(zhì)結(jié)合區(qū),M,No-pro,Pro-DNA,對(duì)在凝膠上出現(xiàn)空白區(qū)域的DNA進(jìn)行克隆測(cè)序，即可確定結(jié)合蛋白質(zhì)的DNA序列,變性凝膠電泳,（2）化學(xué)足跡法 (Chemical footprinting),是利

21、用能切斷DNA骨架的化學(xué)試劑處理DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，從而通過(guò)化學(xué)試劑無(wú)法接近結(jié)合蛋白質(zhì)的DNA區(qū)域而確定DNA的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn) 主要方法： 羥自由基足跡法 體內(nèi)足跡法,1）羥自由基足跡法,化學(xué)試劑,羥自由基,利用化學(xué)試劑產(chǎn)生的羥自由基攻擊DNA分子表面脫氧核糖骨架使DNA斷裂 當(dāng)DNA結(jié)合蛋白將脫氧核糖遮蓋時(shí)，自由羥基無(wú)法攻擊而使這個(gè)區(qū)域的DNA受到保護(hù),電泳圖譜上出現(xiàn)空白區(qū)的地方就是結(jié)合蛋白質(zhì)的DNA區(qū),變性凝膠電泳,2）體內(nèi)足跡法（In vivo footprinting）,用化學(xué)試劑對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)處理，使DNA在細(xì)胞內(nèi)受到化學(xué)修飾，然后裂解細(xì)胞，用化學(xué)法或酶法進(jìn)行足跡實(shí)驗(yàn)。,甲基化干

22、擾實(shí)驗(yàn) (Methylation interference assay)： 是利用化學(xué)試劑如硫酸二甲酯（Dimethyl sulfate, DMS）對(duì)活細(xì)胞DNA進(jìn)行甲基化修飾，從而干擾蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合。,乙基化干擾實(shí)驗(yàn) (Ethylation interference assay)： 是利用化學(xué)試劑對(duì)活細(xì)胞DNA進(jìn)行乙基化修飾，從而干擾蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合。,化學(xué)試劑,提取DNA,DNase I 或化學(xué)試劑,變性凝膠電泳分析,切割DNA,化學(xué)修飾對(duì)蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合有干擾，因此，體內(nèi)足跡實(shí)驗(yàn)也叫干擾實(shí)驗(yàn)； 電泳圖譜需與未修飾的DNA樣品進(jìn)行比較，在未修飾樣品中出現(xiàn)空白區(qū)的位置是體內(nèi)發(fā)生

23、化學(xué)修飾的DNA區(qū)域。,正常對(duì)照,化學(xué)修飾,提取DNA,2. 用電泳遷移率變動(dòng)實(shí)驗(yàn)研究啟動(dòng)子,電泳遷移率變動(dòng)實(shí)驗(yàn)(Electrophoretic mobility shift assay, EMSA) ： 是利用結(jié)合蛋白質(zhì)的DNA片段在凝膠中遷移滯后的特點(diǎn)，通過(guò)電泳分離研究核酸-蛋白質(zhì)互作的方法； 又稱為凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)(Gel retardation assay)。,細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物,標(biāo)記的DNA片段,蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合,蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物電泳遷移滯后,凝膠電泳,顯影,滯后條帶表明DNA是與蛋白質(zhì)結(jié)合的區(qū)域,3. 用染色體免疫沉淀（ChIP）研究啟動(dòng)子,非變性ChIP：是先用核酸酶處理細(xì)胞核，

24、將染色體消化成碎片，然后用合適的抗體將結(jié)合有蛋白質(zhì)的染色體片段通過(guò)免疫沉淀選擇出來(lái)，再以PCR或核酸雜交技術(shù)對(duì)DNA序列進(jìn)行分析； 變性ChIP：是先用甲醛處理細(xì)胞，使蛋白質(zhì)與DNA在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生交聯(lián)，然后分離染色體并進(jìn)行剪切，用特異性抗體與DNA結(jié)合蛋白相結(jié)合，以沉淀法分離DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體。,（三）生物信息學(xué)預(yù)測(cè)啟動(dòng)子,真核基因組的測(cè)序正在以不斷增長(zhǎng)的速度進(jìn)行著； 預(yù)計(jì)在未來(lái)幾年內(nèi)將會(huì)完成更多的基因組測(cè)序工作； 對(duì)基因組注釋工作中最難的就是精確鑒定和描繪啟動(dòng)子，因此，啟動(dòng)子的預(yù)測(cè)就顯得非常重要 。,預(yù)測(cè)啟動(dòng)子的切入點(diǎn)： 啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)特征 啟動(dòng)子在染色體上的位置,1. 啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)特征,典型

25、啟動(dòng)子 核心啟動(dòng)子：一般在TSS上游-35區(qū)域以內(nèi) 近端啟動(dòng)子：一般涉及TSS上游幾百個(gè)堿基 遠(yuǎn)端啟動(dòng)子：一般涉及TSS上游幾千個(gè)堿基 含有增強(qiáng)子或沉默子,一些特征性的結(jié)構(gòu)： TSS附近的CG島經(jīng)常出現(xiàn)在啟動(dòng)子中 共通序列 (consensus sequence)。,2. 啟動(dòng)子的預(yù)測(cè)分析,啟動(dòng)子數(shù)據(jù)庫(kù) EPD (Eukaryotic promoter databases) TRRD (Transcription regulatory regions databases) 基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù) (DBTSS),這些數(shù)據(jù)庫(kù)主要通過(guò)計(jì)算機(jī)識(shí)別、判斷及分析，在數(shù)據(jù)庫(kù)中尋找啟動(dòng)子的特異性特征結(jié)構(gòu)。,二

26、、啟動(dòng)子的功能分析,啟動(dòng)子通常是基因上游參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的DNA序列。由于啟動(dòng)子中的順式作用元件在基因的特異性表達(dá)中發(fā)揮重要作用，因此，可以通過(guò)連接報(bào)告基因研究啟動(dòng)子的功能。,1. 報(bào)告基因 (Reporter gene),是研究者們?yōu)榱酥圃煲环N可在細(xì)胞培養(yǎng)條件下或動(dòng)植物體內(nèi)作為篩選標(biāo)志的易檢測(cè)信號(hào)，通過(guò)分子生物學(xué)操作將發(fā)光蛋白或酶的編碼基因附加到一個(gè)感興趣基因上或插入基因調(diào)控序列下游，從而監(jiān)測(cè)感興趣基因的表達(dá)或分析基因調(diào)控序列的活性 。,常用的報(bào)告基因：,熒光蛋白編碼基因： 綠色熒光蛋白 (GFP) 紅色熒光蛋白 (dsRed) 蛋白酶： 熒光素酶 (luciferase) -半乳糖苷酶,在

27、藍(lán)色光源照射下發(fā)綠光,能催化熒光素 (luciferin)發(fā)生氧化反應(yīng)發(fā)光,能使細(xì)菌在X-gal存在條件下變成藍(lán)色,2. 報(bào)告基因的應(yīng)用,監(jiān)測(cè)基因的轉(zhuǎn)染效率 報(bào)告基因與目的基因分別插入各自啟動(dòng)子下 游，實(shí)現(xiàn)報(bào)告基因的組成性表達(dá)模式。 監(jiān)控目的基因的表達(dá) 報(bào)告基因與目的基因融合共同受控于一個(gè)啟動(dòng)子，報(bào)告基因的表達(dá)即代表目的基因的表達(dá)。 研究啟動(dòng)子的活性 報(bào)告基因插入被研究啟動(dòng)子下游，通過(guò)觀察報(bào)告基因的表達(dá)情況推測(cè)啟動(dòng)子活性。,啟動(dòng)子捕獲技術(shù) (promoter trapping)：是一種研究啟動(dòng)子活性的篩選方法。 基本流程： 構(gòu)建啟動(dòng)子捕獲載體 觀察報(bào)告基因的表達(dá)。,報(bào)告基因,MCS,ori,候

28、選啟動(dòng)子序列,插入MCS,轉(zhuǎn)染細(xì)胞,觀察報(bào)告基因的表達(dá),啟動(dòng)子捕獲載體,第四節(jié) 基因編碼序列的結(jié)構(gòu)分析,主要內(nèi)容： 基因編碼序列的結(jié)構(gòu)特征 基因編碼序列的結(jié)構(gòu)分析,一、基因編碼序列的結(jié)構(gòu)特征,編碼序列 (coding sequence)：通常是指 能體現(xiàn)在蛋白質(zhì)氨基酸序列中的基因信息。 2. 基因的編碼序列具有一些特征性序列： 開(kāi)放閱讀框架 蛋白質(zhì)翻譯的起始密碼子和終止密碼子 真核基因的外顯子（編碼序列）和內(nèi)含子（非編碼序列）之間有特殊序列,（一）開(kāi)放閱讀框架,開(kāi)放閱讀框架 (open reading frame, ORF)： 是指生物基因組中含有能潛在編碼蛋白質(zhì)的一段核苷酸序列 在基因序列中，ORF位于起始密碼子（start codon）和終止密碼子（stop codon）之間,密碼子： 是由三個(gè)核苷酸組成的DNA序列，也稱作三聯(lián)密碼子 生物體基因組中總共有64種密碼子，其中三個(gè)終止密 碼子，61個(gè)編碼氨基酸的密碼子 。,