基因編輯技術的概念和原理

1、基因編輯技術的概念和原理,什么是基因編輯技術？,基因編輯是指對基因組進行定點修飾的一項新技術。利用該技術，可以精確地定位到基因組的某一位點上， 在這位點上剪斷靶標 DNA 片段并插入新的基因片段。此過程既模擬了基因的自然突變， 又修改并編輯了原有的基因組， 真正達成了“編輯基因” 。,基因編輯的研究背景,傳統(tǒng)的動物育種方法受到種源的限制，其程需要耗費大量的人力、物力和財力，經(jīng)歷漫長的培育過程。而且不同種間的雜交很困難，育種成果很難取得突破性進展。,基因編輯的研究背景,現(xiàn)代動物分子育種中，分子標記技術能夠定位與經(jīng)濟性狀相關的分子標記，鎖定基因與性狀的對應關系，從而快捷可靠地對動物后代進行篩選。但

2、是，利用分子標記技術輔助篩選，改良的程度依然受限于品種自身已有的基因。 所以，利用基因工程技術進行品種改良，可以突破種源的限制及種間雜交的瓶頸，獲取新品種，因此分子育種更為本質(zhì)和直接。,基因編輯的研究背景,目前，獲得突變體的常見方法是利用T- DNA 或轉(zhuǎn)座子構建大規(guī)模的隨機插入突變體庫， 但是構建覆蓋全基因組的飽和突變體庫需要的工作量大且耗費的時間長。而通過定點突變的方法使目的基因完全失活，是一種最直接有效的研究特定基因功能的方法。,基因編輯的研究背景,近年來，隨著高特異性及更具操作性的人工核酸酶的出現(xiàn)和技術體系的完善，基因組編輯技術獲得了飛速發(fā)展，并將靶向基因操作推向高潮，使得定點基因敲除

3、、敲入變得更為簡單且高效。,基因編輯的優(yōu)勢,與傳統(tǒng)的以同源重組和胚胎干細胞(embryonic stem cell，ES)技術為基礎的基因打靶技術相比，基因編輯新技術保留了可定點修飾的特點，可應用到更多的物種上，效率更高，構建時間更短，成本更低。,基因編輯原理,現(xiàn)代基因組編輯技術的基本原理是相同的，即借助特異性 DNA 雙鏈斷裂( DNA double-strand breaks DSBs) 激活細胞天然的修復機制，包括非同源末端連接( NHEJ)和同源重組修復(HDR) 兩條途徑。,基因編輯原理,非同源末端連接（NHEJ ）是一種低保真度的修復過程，斷裂的DNA 修復重連的過程中會發(fā)生堿基隨

4、機的插入或丟失，造成移碼突變使基因失活,實現(xiàn)目的基因敲除。如果一個外源性供體基因序列存在，NHEJ 機制會將其連入雙鏈斷裂DSB 位點，從而實現(xiàn)定點的基因敲入。,基因編輯原理,同源重組修復（HR） 是一種相對高保真度的修復過程，在一個帶有同源臂的重組供體存在的情況下，供體中的外源目的基因會通過同源重組過程完整的整合到靶位點，不會出現(xiàn)隨機的堿基插入或丟失。如果在一個基因兩側(cè)同時產(chǎn)生DSB，在一個同源供體存在的情況下，可以進行原基因的替換。,基因編輯原理,基因編輯技術的種類,目前主要有 3 種基因編輯技術， 分別為： 人工核酸酶介導的鋅指核酸酶(zinc- finger nucleases，ZFN

5、)技術； 轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應物核酸酶(transcription activator- like effector nucleases，TALEN)技術； RNA 引導的 CRISPR- Cas 核酸酶技術(CRISPR- Cas RGNs)。,1. ZFN 基因組編輯技術,ZFN 技術是第一代基因組編輯技術，其功能的實現(xiàn)是基于具有獨特的DNA序列識別的鋅指蛋白發(fā)展起來的。1986年Diakun 等首先在真核生物轉(zhuǎn)錄因子家族的 DNA 結(jié)合區(qū)域發(fā)現(xiàn)了Cys2- His2鋅指模塊，到1996年，Kim等首次人工連接了鋅指蛋白與核酸內(nèi)切酶。2005年，Urnov等發(fā)現(xiàn)一對由4個鋅指連接而成的ZFN

6、可識別24 bp的特異性序列，由此揭開了ZFN在基因組編輯中的應用。,ZFN 由鋅指蛋白(ZFP)和 Fok核酸內(nèi)切酶組成。其中，由 ZFP 構成的 DNA 識別域能識別特異位點并與之結(jié)合，而由Fok構成的切割域能執(zhí)行剪切功能，兩者結(jié)合可使靶位點的雙鏈DNA 斷裂(DSB)。于是， 細胞可以通過同源重組(HR)修復機制和非同源末端連接(NHEJ)修復機制來修復 DNA。HR 修復有可能會對靶標位點進行恢復修飾或者插入修飾，而 NHEJ 修復極易發(fā)生插入突變或缺失突變。兩者都可造成移碼突變，因此達到基因敲除的目的。,ZFN 誘導的基因組編輯技術可應用于很多物種及基因位點，具有較好的發(fā)展?jié)摿?。但?/p>

7、目前有 3 個方面的缺陷制約了該技術的推廣:(1)以現(xiàn)有的策略設計高親和性的 ZFN， 需要投入大量的工作和時間;(2)在細胞中持續(xù)表達 ZFN 對細胞有毒性;(3)雖然三聯(lián)體設計具有一定特異性，但仍然存在不同程度的脫靶效應。,2. TALEN 基因組編輯技術,2009 年，研究者在植物病原體黃單胞菌(Xanthomonas)中發(fā)現(xiàn)一種轉(zhuǎn)錄激活子樣效應因子，它的蛋白核酸結(jié)合域的氨基酸序列與其靶位點的核酸序列有較恒定的對應關系。隨后，TALE特異識別 DNA 序列的特性被用來取代 ZFN技術中的鋅指蛋白。它可設計性更強，不受上下游序列影響，具備比ZFN 更廣闊的應用潛力。,TALENs 包含兩個

8、 TALEN 蛋白, 每個 TALEN 都是由 TALE array 與 Fok融合而成. 其中一個 TALEN 靶向正義鏈上靶標位點, 另一個則靶向反義鏈上的靶標位點. 然后 Fok形成二聚體, 在靶向序列中間的 spacer 處切割 DNA, 造成雙鏈 DNA 斷裂, 隨后細胞啟動 DNA 損傷修復機制. 針對不同的TALEN 骨架, 其最適宜的spacer長度不同, 其長度范圍一般為1220 bp. 實驗結(jié)果表明, TALENs在靶向DNA時, 第一個堿基為 T 時其結(jié)合效果更佳。,目前， TALEN 已經(jīng)成功應用于酵母、 哺乳動物和植物的位點特異性基因打靶， 與鋅指核酸酶系統(tǒng)相比有較大

9、的應用優(yōu)勢， 但仍然有些問題需要解決，例如:脫靶效應、TALEN 與基因組進行特異結(jié)合與染色體位置及鄰近序列有關等。,3. CRISPR /Cas9 基因組編輯技術,1987年，Ishino 等在K12大腸桿菌的堿性磷酸酶基因附近發(fā)現(xiàn)串聯(lián)間隔重復序列，隨后發(fā)現(xiàn)這種間隔重復序列廣泛存在于細菌和古細菌的基因組中。經(jīng)過幾十年的研究，在2007年終于證明這種重復序列與細菌獲得性免疫的關系。,在這個系統(tǒng)中，只憑借一段 RNA 便能識別外來基因并將其降解的功能蛋白引起了研究者的興趣。直到2012 年，Jinek 等第一次在體外系統(tǒng)中CRISPR/Cas9 為一種可編輯的短RNA 介導的DNA核酸內(nèi)切酶，標

10、志著 CRISPR /Cas9 基因組編輯技術成功問世。,3. CRISPR /Cas9 基因組編輯技術,CRISPR/Cas 系統(tǒng)由 Cas9 核酸內(nèi)切酶與sgRNA構成. 轉(zhuǎn)錄的 sgRNA 折疊成特定的三維結(jié)構后與 Cas9 蛋白形成復合體, 指導 Cas9 核酸內(nèi)切酶識別特定靶標位點, 在 PAM 序列上游處切割 DNA 造成雙鏈 DNA 斷裂, 并啟動 DNA 損傷修復機制. 從不同菌種中分離的 CRISPR/Cas 系統(tǒng), 其 CrRNA(或者是人工構建的sgRNA)靶向序列的長度不同, PAM 序列也可能不同。,三種不同技術的比較,續(xù)表,基因編輯新技術的用途,基因功能研究 基因治

11、療 構建模式動物 改造和培育新品種,1. 基因功能研究,基因敲除是在活體動物上驗證基因功能必不可少的邏輯環(huán)節(jié)， 但是傳統(tǒng)的基因敲除方法需要通過復雜的打靶載體構建、 ES 細胞篩選、 嵌合體動物模型選育等一系列步驟， 成功率受到多方面因素的限制。,1. 基因功能研究,即使對于技術比較成熟的實驗室， 利用傳統(tǒng)技術敲除大鼠或小鼠身上的某個基因一般也需要 1 年以上。基因編輯新技術則不然， 敲除基因高效快速， 是研究基因功能的有力工具。,1. 基因功能研究,ZFN 技術已在大鼠、小鼠、斑馬魚、果蠅、擬南芥、玉米、煙草 等模式生物或經(jīng)濟物種的細胞或胚胎中以及包括誘導多能干細胞(induced pluri

12、potent stem cells，iPSC)在內(nèi)的人體外培養(yǎng)細胞系中成功地實現(xiàn)了內(nèi)源基因的定點突變，其中在果蠅、 斑馬魚、大鼠等物種中還獲得了可以穩(wěn)定遺傳的突變體。,1. 基因功能研究,2009 年， 威斯康辛醫(yī)學院、 Sangamo Biosciences、 Sigma- Aldrich 等多家機構使用 ZFN 技術，成功培育出首只靶基因敲除的大鼠，而且?guī)в性撏蛔兊拇笫笏暮蟠瑯訋в性摶蛲蛔儭?2. 基因治療,傳統(tǒng)的基因治療是將正常的基因片段引入細胞中替代有缺陷的基因， 但這種方法難以精準控制， 可能產(chǎn)生很大的毒副作用。基因編輯新技術可以精確定位， 在靶位點進行修正或進行基因切除，

13、 達到基因治療的目的。,2. 基因治療,Bacman 等人利用 TALEN 技術清除了來自于病人線粒體內(nèi)的有病 DNA。這是 TALEN 首次應用于線粒體基因的編輯，這項研究有望用于治療母系遺傳的線粒體病。,2. 基因治療,Li 等人利用 ZFN 技術能在染色體上精確定位的優(yōu)勢， 通過 “剪切” 和 “粘貼” 基因， 在實驗小鼠體內(nèi)實現(xiàn)了血友病治療， 避免了傳統(tǒng)基因療法帶來的插入誘變風險， 首次取得了基因組編輯在基因療法上的突破。,3. 構建模式動物,根據(jù)人類疾病所構建的動物模型，對研究這些疾病的發(fā)生及其治療有著重要意義?；虼虬屑夹g是在 ES 和同源重組技術的基礎上發(fā)展起來的，模型構建耗時長

14、、成本高，且模式動物的選擇受到 ES 細胞的限制。,基因編輯新技術不受 ES 細胞的限制，效率高，速度快，且定點編輯更加精確，可在多種細胞及生物體的特定位點進行切割和修飾。構建轉(zhuǎn)基因小鼠第一人 Jaenisch 與其同事最近利用 CRISPR- Cas 系統(tǒng)又構建了攜帶特異性突變的小鼠模型。,3. 構建模式動物,4. 改造和培育新品種,傳統(tǒng)的改造動植物品種的轉(zhuǎn)基因技術是將外源 DNA 片段插入受體的基因組中，改造基因功能，使其表達優(yōu)良的性狀，獲得人類需要的品種?；蚓庉嫾夹g則可以進行定點修飾， 達到高效定向。,Shukla 等對玉米進行肌醇磷酸激酶 1(inositol phosphate k

15、inase 1，IPK1)基因的修飾，使其對除草劑的耐性增強，在發(fā)育的種子中肌醇磷酸鹽表達譜也發(fā)生了與預期一樣的改變。 Townsend等以煙草中的丙酮醇合酶(acetolactate synthase)基因 SuR (SuRA和SuRB)位點為靶標，育成了對咪唑啉酮(imidazolinone)除草劑和對磺脲(sulphonylurea)除草劑都有抵抗力的新品種。,基因編輯的不足,基因編輯是一項新技術， 還存在構建復雜和價格的問題， 其脫靶效應限制了其在基因治療等應用上的發(fā)展。,基因編輯技術的展望,隨著越來越多物種基因組測序的完成，基因功能的研究成為后基因時代的重點。基因編輯技術既可以用正?；蛱娲蛔兓蜻M行性狀改良和基因治療，也可以用突變基因代替正?；蜻M行基因功能的研究。,基因編輯技術的展望,與傳統(tǒng)的基因打靶技術相比，基因編輯技術擺脫了對 ES 細胞的限制，可以應用于更多的物種，且定向修飾更加精確，效率更高，所需時間更短,得到的突變可以通過種系遺傳.其中，CRISPR 系統(tǒng)可以同時進行多靶點的切割，易于得到純合子突變體。,基因編輯技術的