PCR引物設(shè)計及測序結(jié)果分析.ppt

1、PCR引物設(shè)計及測序結(jié)果分析,Content,聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR） 的技術(shù)原理及結(jié)果分析 PCR引物設(shè)計原理及相關(guān)軟件的使用（ Primer Premier 5.0 ） 測序結(jié)果分析,一 . PCR的技術(shù)原理及結(jié)果分析,聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)，是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法，故又稱為基因的體外擴增法。 PCR不僅可以用于基因的分離、克隆和核苷酸序列分析，還可以用于突變體和重組體的構(gòu)建，基因表達調(diào)控的研究，基因多態(tài)性的分析，遺傳病和傳染病的診斷，腫瘤機制的探索，法醫(yī)鑒定等諸多方面。,PCR技術(shù)原理,以擬擴增的DNA分子為模

2、板，以一對分別與模板5末端和3末端互補的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留復制的機制沿著模板鏈延伸直至完成新的DNA合成，重復這一過程，即可使目的DNA片段得到擴增。,正義鏈,反義鏈,基本分子生物學研究手段,PCR,PCR反應(yīng)液體的成分: PCR循環(huán)的程序: PCR原理：,基本分子生物學研究手段,RT-PCR 反轉(zhuǎn)錄PCR,mRNA-cDNA-PCR,基本分子生物學研究手段,Cutting by enzymes,基本分子生物學研究手段,Southern Blot,基本分子生物學研究手段,Northern Blot,PCR技術(shù)的基本過程,模板DNA dNTP 引物 Buffe

3、r,預變性,模板DNA dNTP 引物 Buffer,TaqDNA聚合酶,循環(huán)儀,94oC 5,94 55 72 ,模板與引物的復性,引物是與模板某區(qū)序列互補的一小段DNA片段。 Tm,在加熱或堿性條件下可使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈DNA 94C,從結(jié)合在特定DNA模板上的引物為出發(fā)點，按53的方向沿著模板順序合成新的DNA鏈 72C,變性,退火,延伸,PCR出現(xiàn)的問題： PCR擴增未得到目的條帶？ 擴增出目的條帶之外的多條帶（非特異性）？ 擴增的目的條帶很弱？,引物是否合適?,引物設(shè)計是PCR 技術(shù)中至關(guān)重要的一環(huán),PCR結(jié)果分析,PCR結(jié)果。12、PCR產(chǎn)物（3ul樣品）,PCR常

4、見問題,1. 無擴增產(chǎn)物,模板:含有抑制物，含量低 Buffer對樣品不合適 引物設(shè)計不當或者發(fā)生降解 退火溫度太高,2. 非特異性擴增,引物特異性差 模板或引物濃度過高 酶量過多 退火溫度偏低 循環(huán)次數(shù)過多,3. 拖尾,產(chǎn)物在凝膠上呈Smear狀態(tài),M 1 2,模板不純或降解 Buffer不合適 退火溫度偏低 酶量過多 dNTP、Mg2+濃度偏高 循環(huán)次數(shù)過多,4. 假陽性（篩選轉(zhuǎn)基因、檢測基因表達情況),交叉污染,對策,操作時防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外； 除不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑器材均高壓消毒。離心管及槍頭等一次性使用。 各種試劑先進行分裝，低溫貯存。 設(shè)置陽性和陰性對照

5、，重復實驗,1、目的基因的克?。?PCR技術(shù)為在重組DNA過程中獲得目的基 因片段提供了簡便快速的方法。 2、基因的體外突變： 可以隨意設(shè)計引物在體外對目的基因片段 進行嵌和、缺失、點突變等改造。,PCR的應(yīng)用,3、DNA和RNA的微量分析： PCR技術(shù)高度敏感，對模板的含量要求很低，是DNA和NA微量分析的最好方法。實際工作中，一滴血液、一根毛發(fā)或一個細胞已足以滿足PCR的檢測需要，因此在基因診斷方面具有極廣闊的應(yīng)用前景。 4、基因轉(zhuǎn)錄水平檢測 RT-PCR可檢測不同組織或細胞中基因的轉(zhuǎn)錄水平. 5、基因突變分析： 利用PCR與一些技術(shù)的結(jié)合可以大大提高基因突變檢測的敏感性。,二. PCR引

6、物設(shè)計原理及相關(guān)軟件的使用（ Primer Premier 5.0 ）,引物 引物的重要性 引物設(shè)計的原則 引物同源性分析 引物設(shè)計軟件 如何使用Primer Premier 5.0 酶切位點及保護堿基的添加,引物（primers),引物是人工合成的兩段寡核苷酸序列，一個引物與感興趣區(qū)域一端的一條DNA模板鏈互補，另一個引物與感興趣區(qū)域另一端的另一條DNA模板鏈互補。(上游引物與DNA序列一致,下游引物要反相互補.),3,3,5,5,Sense primer,Antisense primer,引物的重要性,在整個PCR體系中, 引物占有十分重要的地位。PCR的特異性要求引物與靶DNA特異結(jié)合，

7、不與其他非目的DNA結(jié)合，PCR的靈敏性要求DNA聚合酶能對引物進行有效的延伸，可見引物設(shè)計好壞與PCR結(jié)果密切相關(guān)。,引物設(shè)計原則,引物長度 堿基分布的均衡性 Tm值 引物二級結(jié)構(gòu) 引物3端 引物5端 引物的內(nèi)部穩(wěn)定性 引物的保守性與特異性 擴增區(qū)域的二級結(jié)構(gòu),引物與模板的序列要緊密互補 引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu) 引物不能在模板的非目的位點引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)(即錯配)。,基本原則：,引物長度（primer length） 產(chǎn)物長度（product length） 序列Tm 值(melting temperature) 形成引物二聚體(primer dimer)及發(fā)夾結(jié)構(gòu)

8、（duplex formation and hairpin）的能值 在錯配位點（false priming site）的引發(fā)效率 引物及產(chǎn)物的GC含量（composition）,具體因素：,一般原則：,1. 引物的長度：配對引物的長度一般在15-30bp之間比較合適。 盡可能使用兩條引物的Tm值相同（最好相差不要超過 5） Tm值的計算：一般的公式：Tm = 4 (G+C) + 2(A+T) 2. 引物的GC%含量：一般為40%-60%。上下游引物的GC含量不能相差太大。,3. 引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當沒有相似性較高，尤其是3端相似性較高的序列，否則容易導致錯配。 4. 引物3端的末位堿基避開密碼

9、子的第3位，且最好不選擇A 5. 引物的5端可以修飾，而3端不可修飾。,6. 引物無回文對稱結(jié)構(gòu)，否則會形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)；引物自身不能配對，否則易形成約兩個引物長度的引物二聚體；,發(fā)夾結(jié)構(gòu),引物二聚體,7. 引物5端可以有與模板DNA不配對堿基，在5端引入一段非模板依賴性序列。 5端加上限制性核酸內(nèi)切酶位點序列（酶切位點5端加上適當數(shù)量的保護堿基）。 5端的某一位點修改某個堿基，人為地在產(chǎn)物中引入該位點的點突變以作研究。 5端標記放射性元素或非放射性物質(zhì)（如生物素、地高辛等）。,8. 引物的保守性與特異性,保守性：通用引物檢測同一類病原微生物盡可能多的型別 特異性：避免非特異性擴增,引物同源性分析

10、,用Blastn軟件進行同源性比較 盡可能選擇與非目的基因同源性小的序列作為引物 選擇3端與非目的基因不同源的序列作為引物,引物設(shè)計軟件,Primer Premier 5.0 生物軟件網(wǎng)下載 安裝后，用文本編輯器打開WIN.INI，將vspace=DU改為vspace=PU便可以使用全部功能。 Oligo primer 3 The Primer Generator NetPrimer,如何使用Primer Premier 5.0,引物設(shè)計 一般引物設(shè)計 5帶酶切位點引物設(shè)計 巢式PCR引物設(shè)計 多重PCR引物設(shè)計 探針設(shè)計 引物評析,Primer Premier 5.0主要功能: 1、引物設(shè)計

11、 2、限制性內(nèi)切酶位點分析 3、DNA 基元(motif)查找 4、同源性分析,Primer Premier 5.0使用介紹,Preimer Premier 啟動界面,Load sequence,Sequence name,Original sequence,Use these two button to translate the DNA seq to a protein seq or a protein seq to a DNA seq 8種密碼子偏好,Choose a function,引物設(shè)計界面,引物設(shè)計界面,First you can design the primer manua

12、lly,Sense strand or anti-sense strand,Useful information of the primer,引物搜索選項設(shè)定,引物類型,搜索模式,5引物位置范圍,3引物位置范圍,產(chǎn)物大小范圍,引物長度,搜索結(jié)果,28對引物,引物分值 100分為滿分,每對引物的信息,雙擊選中一對引物,引物信息,回到主窗口,引物及產(chǎn)物信息,是否出現(xiàn)hairpin,dimer,false priming and cross dimer,引物編輯,引物編輯,編輯引物,分析引物結(jié)果,確認編輯的引物,基因克隆,酶切位點及保護堿基的添加,酶切位點的查找,酶切位點的選擇原則:,DNA序列當中不含