▏目的基因的獲取詳版[優(yōu)質(zhì)內(nèi)容]

1、第四章 目的基因的獲取,目的基因：,準備要分離、改造、擴增或表達的基因。,1,高級培訓,第一節(jié) 基因組DNA片斷化,一、限制性內(nèi)切酶法,用限制性內(nèi)切酶把基因組DNA切成不同大小的片斷。,酶切,2,高級培訓,由于帶有粘性末端，產(chǎn)物可以直接與載體連接。,1. 優(yōu)點,2. 缺點,目的基因內(nèi)部也可能有該內(nèi)切酶的切點。目的基因也被切成碎片！,BamH I,BamH I,BamH I,gene,3,高級培訓,二、隨機片斷化,1. 限制性內(nèi)切酶局部消化法,控制內(nèi)切酶的用量和消化時間，使基因組中的酶切位點只有一部分被隨機切開。, 內(nèi)切酶識別位點的堿基數(shù),影響所切出的產(chǎn)物的長度和隨機程度。,（1）限制性內(nèi)切酶的

2、選用原則,4,高級培訓,1）4bp的內(nèi)切酶,平均每46（4096）bp一個切點。,2）6bp的內(nèi)切酶,平均每44（256）bp一個切點。,隨機程度高。如Hae、AluI、Sau3A。, 內(nèi)切酶粘性末端,能與常用克隆位點相連。,（Sau3ABamH I）,5,高級培訓,2. 機械切割法,（1）超聲波,超聲波強烈作用于DNA，可使其斷裂成約300bp的隨機片斷。,（2）高速攪拌,1500轉(zhuǎn)/分下攪拌30min，可產(chǎn)生約8kb的隨機片斷。,6,高級培訓,1976年H.G. Khorana提出了用化學方法合成基因的設(shè)想，并于1979年在science上發(fā)表了率先成功地合成大腸桿菌酪氨酸t(yī)RNA基因的論

3、文。,第二節(jié) 化學合成目的基因,一、目前常用的方法,磷酸二酯法、,磷酸三酯法、,亞磷酸三酯法、,固相合成法,自動化合成法。,7,高級培訓, 保護dNTP的5端P 或3端-OH, 用酸或堿的脫保護,（1）原理,1. 磷酸二酯法, 帶保護的單核苷酸連接,保證合成反應的定向進行。,帶5保護的單核苷酸與帶3保護的另一個單核苷酸以磷酸二酯鍵連接起來。,8,高級培訓,（2）合成過程,下一個5端保護的單核苷酸又可以同3端保護的二核苷酸聚合。,9,高級培訓,原理與磷酸二酯法一樣。只是參加反應的單核苷酸都是在3端磷酸和5-OH上都先連接了一個保護基團。,2. 磷酸三酯法,10,高級培訓,將第一個核苷酸的3-OH

4、端固定在固相支持物上。,固相磷酸三酯合成法,是目前通用的合成方法。,15,合成的二核苷酸連接處有三個酯鍵！,11,高級培訓,固相磷酸三酯合成過程,固相支持物,結(jié)果是全保護的DNA：5 DMT, 3固相支持物, 核苷酸之間對氯苯。最后脫保護,固相 支持物,固相 支持物,C,12,高級培訓,化學合成的DNA片斷一般在200bp以內(nèi)。,二、 化學合成DNA片斷的組裝,用T4多核苷酸激酶使各個片段的5端帶上磷酸。,1. 互補連接法,預先設(shè)計合成的片斷之間都有互補區(qū)域，不同片斷之間的互補區(qū)域能形成有斷點的完整雙鏈。,（2）5端磷酸化,（1）互補配對,（合成的DNA單鏈的5端是-OH）,13,高級培訓,T

5、4 DNA連接酶,T4多核苷酸激酶,使5-OH磷酸化,完整的DNA雙鏈,（3）連接酶連成完整雙鏈,14,高級培訓,2. 互補延伸連接法,預先設(shè)計的片斷之間有局部互補區(qū)，可以相互作為另一個片斷延長的引物，用DNA聚合酶延伸成完整的雙鏈。,3,5,5,3,5,3,T4DNA連接酶,Klenow片段,引物,15,高級培訓,1. 直接合成基因,三、 寡聚核苷酸化學合成的優(yōu)點,2. 合成引物（20mer左右）,（1）mRNA的含量很低，很難作cDNA,3. 合成探針序列,4. 定點突變合成,合成帶有定點突變的基因片斷。,（2）有些基因比較短，化學合成費用較低,16,高級培訓,DNA合成儀,5. 合成人工

6、接頭或銜接物,含有各種酶切位點人工接頭（Adaptor）或銜接物（Linker）序列。,EcoRI,EcoRI,Linker,Adaptor,17,高級培訓,將某種生物細胞的整個基因組DNA切割成大小合適的片斷，并將所有這些片斷都與適當?shù)妮d體連接，引入相應的宿主細胞中保存和擴增。 理論上講，這些重組載體上帶有了該生物體的全部基因，稱為基因文庫。,一、基因文庫的構(gòu)建,1. 基因文庫（gene library）,第三節(jié) 目的基因的保存和擴增,18,高級培訓,（2）目前常用的載體,2. 構(gòu)建基因文庫的載體選用,載體能夠容載的DNA片斷大小直接影響到構(gòu)建完整的基因文庫所需要的重組子的數(shù)目。,載體容量越

7、大，所要求的DNA片斷數(shù)目越少，所需的重組子越少。,（1）對載體的要求,載體系列： 容量為 24 kp cosmid載體： 容量為 50 kb YAC： 容量為 1 Mb BAC: 容量為 300 kb,19,高級培訓,斷點完全隨機，片斷長度合適于載體連接。不能用一般的限制性內(nèi)切酶消化法。,（1）染色體DNA大片段的制備,3. 基因文庫構(gòu)建的一般步驟,超聲波（300bp）或機械攪拌（8kb）。, 物理切割法：,內(nèi)切酶Sau3A進行局部消化?？傻玫?0-30kb的隨機片斷。, 酶切法：,20,高級培訓,（2）載體與基因組DNA大片段的連接, 粘性末端直接連接,載體與外源DNA大片段的兩個末端都有

8、相同的粘性末端。,如：Sau3A與BamHI的酶切末端。,直接連接、人工接頭或同聚物加尾。,人工接頭法（adapter）,人工合成的限制性內(nèi)切酶粘性末端片斷。,21,高級培訓,各種酶的接頭可以向公司定做或購買。,接上人工接頭,粘性末端,CCC,CCC,末端轉(zhuǎn)移酶,粘性末端, 同聚物加尾,22,高級培訓,23,高級培訓,4. 基因組文庫的大小,一個文庫要包含99%的基因組DNA時所需要的克隆數(shù)目。,N=,ln (1-p),ln (1-f),p: 文庫包含了整個基因組DNA的概率（99%）,f: 插入載體的DNA片斷的平均長度占整個基因 組DNA的百分數(shù),N：所需的重組載體數(shù)（克隆數(shù)）,24,高級

9、培訓,例如：人的基因組是 3109 bp，插入DNA片斷的平均長度如果是1.7104 bp,N=,ln (1-p),ln (1-f),=,ln (1-99%),ln (1-f),=,4.61,G,f,N=,4.61,G,f,G：Genome大?。籪：fragment大小,N=,4.61,G,f,=,4.61,3109,1.7104,= 8.1105,25,高級培訓,1. cDNA,以mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄出的DNA稱cDNA。,2. cDNA library,二、 cDNA文庫的構(gòu)建,mRNA,cDNA,3,3,5,5,反轉(zhuǎn)錄酶,引物,利用某種生物的總mRNA合成cDNA，再將這些cDNA與載體

10、連接，轉(zhuǎn)入細菌細胞中進行保存和擴增，稱cDNA文庫。,26,高級培訓,（1）不含內(nèi)含子序列。 （2）可以在細菌中直接表達。 （3）包含了所有編碼蛋白質(zhì)的基因。 （4）比DNA文庫小的多，容易構(gòu)建。,4. 構(gòu)建cDNA文庫的一般步驟,（1）總RNA（total RNA）提取,3. cDNA文庫的特點,提取總RNA有商業(yè)化的試劑盒（kit）。,27,高級培訓,分離mRNA用商業(yè)化的Oligo dT纖維柱。,利用mRNA都含有一段polyA尾巴，將mRNA從總RNA（rRNA、tRNA等）中分離純化。 mRNA只占總RNA的1%-2%。,（2）mRNA的分離純化, 原理, mRNA的分離純化,Col

11、umn（柱）,28,高級培訓,29,高級培訓,反轉(zhuǎn)錄酶,（3）cDNA的合成, cDNA第一鏈合成,逆轉(zhuǎn)錄酶能以RNA為模板合成DNA。 用Oligo dT（或隨機引物）作引物，合成cDNA的第一鏈。,mRNA,cDNA,3,5,5,AAAAAAA,TTTTTTT,Oligo dT引物,30,高級培訓,用堿處理或用RNaseH降解mRNA-DNA雜交分子中的mRNA。,mRNA,cDNA,3,3,5,5,反轉(zhuǎn)錄酶,引物,mRNA,cDNA第一鏈,3,3,5,5,引物,cDNA第一鏈,3,5,引物, 降解mRNA模板,或RNaseH,堿,31,高級培訓,剩下的cDNA單鏈的3末端一般形成一個彎回

12、來的雙鏈發(fā)卡結(jié)構(gòu)（機理不明），可成為合成第二條cDNA鏈的引物。用DNA聚合酶合成第二鏈DNA.。,cDNA第一鏈,5,cDNA第二鏈合成,DNA聚合酶,cDNA第一鏈,cDNA第二鏈,5,3, cDNA第二鏈合成,32,高級培訓,去掉發(fā)卡結(jié)構(gòu),核酸酶S1,用核酸酶S1可以切掉發(fā)卡結(jié)構(gòu)（但這會導致cDNA中有用的序列被切掉！）。,cDNA第一鏈,cDNA第二鏈,5,3,cDNA第一鏈,cDNA第二鏈,5,3,5,3,33,高級培訓,34,高級培訓,這種酶能識別mRNA-cDNA雜交分子中的mRNA，并將其降解成許多小片斷。,妙用RNaseH,小片斷正好成為DNA聚合酶的引物，用來合成岡崎片斷。

13、,DNA Pol I除去引物并修補后再使用DNA連接酶連成一整條DNA鏈。,35,高級培訓,mRNA,cDNA,3,5,反轉(zhuǎn)錄酶,引物,mRNA,cDNA第一鏈,3,5,引物,mRNA,cDNA第一鏈,3,5,mRNA,mRNA,DNA 聚合酶,DNA 聚合酶,cDNA第二鏈,cDNA第一鏈,3,5,RNaseH,DNA ligase,去引物,36,高級培訓,37,高級培訓,在雙鏈cDNA末端接上人工接頭，即可與載體連接，轉(zhuǎn)入受體菌。 或借助末端轉(zhuǎn)移酶給載體和雙鏈cDNA的3端分別加上幾個C或G，成為粘性末端。,5.cDNA與載體連接：,接上人工接頭,粘性末端,CCC,CCC,末端轉(zhuǎn)移酶,38

14、,高級培訓,39,高級培訓,6. cDNA文庫的大小,一個cDNA文庫要包含99%的mRNA時所需要的克隆數(shù)目。,N=,ln (1-p),ln (1- ),p: 文庫包含了完整mRNA的概率（99%）,: 某一種低豐度（不足14份拷貝）mRNA占細胞整個mRNA的比例,N：所需的重組載體數(shù)（克隆數(shù)）,1,n,1,n,40,高級培訓,三、文庫的查詢（screening）,用目的基因探針與文庫中的重組載體進行Southern blot雜交。,文庫,載體,探針,電泳后雜交放射自顯影,測序分析,41,高級培訓,第四節(jié) 目的基因的分離和擴增,一、目的基因的分離,1. 探針柱分離特異mRNA,根據(jù)已知的基

15、因序列合成探針，結(jié)合到纖維素柱上，用來分離純化該基因的mRNA。,富集特定基因的mRNA或cDNA模板。,42,高級培訓,纖 維 柱,探針DNA,探針DNA,探針DNA,探針DNA,Total mRNA,纖 維 柱,探針DNA,探針DNA,探針DNA,探針DNA,過柱,與探針堿基互補的mRNA結(jié)合到柱上，其它mRNA流走。,特異mRNA,洗脫,RT-PCR,43,高級培訓,2. mRNA消解雜交,原理：,羥基磷灰石柱,結(jié)合單鏈DNA-RNA或DNA-DNA雙鏈，不結(jié)合單鏈DNA。,（Hydroxylapatite column）,44,高級培訓,從表達A蛋白和不表達A蛋白的組織細胞中分別提取和

16、分離總mRNA。 將表達A蛋白的mRNA合成cDNA第一鏈。再同不表達A蛋白的總mRNA雜交成cDNA-mRNA雙鏈。 不能雜交的cDNA就包括特異表達的A基因的cDNA單鏈。 用羥磷灰石柱收集單鏈cDNA，合成為雙鏈DNA進行擴增、克隆、測序。,45,高級培訓,A,A,A組織,B組織,總mRNA（A）,總mRNA（B）,含蛋白A的mRNA,不含蛋白A的mRNA,總cDNA第一鏈,A,雜交,內(nèi)含蛋白A 的cDNA,羥磷灰石柱,過柱,吸收RNA-DNA,單鏈濾過,羥磷灰石柱,B,A,PCR,16,cDNA文庫,46,高級培訓,3. mRNA差異顯示PCR（DD RT-PCR）,mRNA diff

17、erential display RT-PCR,（1）3端的錨定引物,Oligo(dT)引物的3端加兩個核苷酸（倒數(shù)第二個不再是T）。,AAAAAAAAAAAAAAAA,mRNA,3,5,NM,TTTTTTTT,M：A、G or C N: A、G、T or C,5,3,47,高級培訓,（2）12種錨定引物,AG,TTTTTTTT,5,3,CG,TTTTTTTT,5,3,GG,TTTTTTTT,5,3,TG,TTTTTTTT,5,3,AA,TTTTTTTT,5,3,CA,TTTTTTTT,5,3,GA,TTTTTTTT,5,3,TA,TTTTTTTT,5,3,AC,TTTTTTTT,5,3,CC

18、,TTTTTTTT,5,3,GC,TTTTTTTT,5,3,TC,TTTTTTTT,5,3,48,高級培訓,（3）5端的隨即引物,10 mer,AAAAAAAAAAAAAAAA,mRNA,3,5,NM,TTTTTTTT,5,3,擴增cDNA第一鏈。,RT,NM,TTTTTTTT,5,cDNA,3,NNNNNNNNNN,5,3,NNNNNNNNNN,5,3,cDNA第二鏈，并PCR,49,高級培訓,（4）隨機引物與錨定引物成對擴增,12種錨定引物，若與20種隨機引物，可組成240組引物。,引物組合：,240組在能分出20000多條帶！,實驗結(jié)果：,如果每條帶相當于一種mRNA，20000 mRNA基本上反映了一種特定細胞中全部的mRNA。,在測序膠上，每組擴出50-100條長度為100-500bp的帶。,50,高級培訓,（5）隨機-錨定引物PCR的產(chǎn)物電泳比較,不同組織的240組引物組合PCR產(chǎn)物在測序膠中電泳。,選擇有差異的帶，進一步PCR作探針。,篩選文庫，找到差別基因的全長序列。,51,高級培訓,二、PCR擴增獲得目的基因,1. 直接從基因組中擴增,（1）提取基因組DNA作模板,（2）根據(jù)目的