分子生物學(xué)技術(shù)之DNA重組技術(shù)（ppt 35頁(yè)）.ppt

1、第五章 分子生物學(xué)技術(shù) DNA重組技術(shù)及應(yīng)用,現(xiàn)代分子生物學(xué)的快速發(fā)展，得益于上個(gè)世紀(jì)中葉以來(lái)研究方法、特別是基因操作和基因工程技術(shù)的進(jìn)步。 基因操作主要包括DNA分子的切割與連接、雜交、電泳、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、核酸序列分析以及基因人工合成、表達(dá)、定點(diǎn)突變和PCR擴(kuò)增等，是分子生物學(xué)研究的核心技術(shù)。,基因工程是指在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，使之進(jìn)入原先沒(méi)有這類(lèi)分子的寄主細(xì)胞內(nèi)并進(jìn)行持續(xù)穩(wěn)定的繁殖和表達(dá)。 基因工程技術(shù)是核酸操作技術(shù)的一部分，只不過(guò)它強(qiáng)調(diào)了外源核酸分子在另一種不同的寄主細(xì)胞中的繁衍與性狀表達(dá)。 事實(shí)上，這種跨越物種屏障、把來(lái)自其它生物的基因置于新的

2、寄主生物細(xì)胞之中的能力，是基因工程技術(shù)區(qū)別于其它技術(shù)的根本特征。,重組DNA技術(shù)發(fā)展史上的重大事件 三大成就： 一、在20世紀(jì)40年代確定了遺傳信息的攜帶者、即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問(wèn)題； 二、50年代提出了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機(jī)制,解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問(wèn)題；,三、50年代末至60年代，相繼提出了“中心法則”和操縱子學(xué)說(shuō),成功地破譯了遺傳密碼，闡明了遺傳信息的流動(dòng)與表達(dá)機(jī)制。,5.1 基因操作的基本工具 （一）限制性核酸內(nèi)切酶 能夠識(shí)別DNA上的特定堿基序列并從這個(gè)位點(diǎn)切開(kāi)DNA分子。 第一個(gè)核酸內(nèi)切酶EcoRI是Boyer實(shí)驗(yàn)室在

3、1972年發(fā)現(xiàn)的，它能特異性識(shí)別GAATTC序列，將雙鏈DNA分子在這個(gè)位點(diǎn)切開(kāi)并產(chǎn)生具有粘性末端的小片段。,圖5-1 幾種主要DNA內(nèi)切酶所識(shí)別的序列及其酶切末端。,（二）基因克隆的載體,我們知道僅僅能在體外利用限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶進(jìn)行DNA的切割和重組，還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足基因工程的要求，因?yàn)榇蠖鄶?shù) DNA片段不具備自我復(fù)制的能力，只有將他們連接到具備自主復(fù)制能力的DNA分子上，才能在寄主細(xì)胞中進(jìn)行繁殖。,載體（vector)是指具備自主復(fù)制的DNA分子，象病毒、噬菌體和質(zhì)粒等相對(duì)分子量較小的復(fù)制子均可以作為基因?qū)氲妮d體。,載體三要素： 自我復(fù)制能力； 攜帶外源基因片段大小（具有較小

4、的分子量和較高的拷貝數(shù)）； 插入位點(diǎn)多少（具有若干限制酶單一識(shí)別位點(diǎn)）； 易于鑒定識(shí)別（具有抗菌素抗性基因）,大腸桿菌質(zhì)粒載體: 1、pSC101質(zhì)粒載體 低拷貝數(shù)嚴(yán)緊型復(fù)制控制的大腸桿菌質(zhì)粒載體，平均每個(gè)寄主細(xì)胞僅有12個(gè)拷貝。 長(zhǎng)9.09kb，帶有四環(huán)素抗性基因（tetr）及EcoRI、HindIII、BamHI、SalI、XhoI、PvuII以及SmaI等7種限制性核酸內(nèi)切酶的單酶切位點(diǎn)，在HindIII、BamHI和SalI等3個(gè)位點(diǎn)插入外源基因，會(huì)導(dǎo)致tetr失活。,大腸桿菌pSC101質(zhì)粒載體示意圖。,是第一個(gè)真核基因克隆載體。缺點(diǎn)：它是一種嚴(yán)緊型復(fù)制控制的低拷貝質(zhì)粒，從帶有該質(zhì)粒

5、的寄主細(xì)胞中提取pSC101 DNA，產(chǎn)量很低。,2、ColE1質(zhì)粒載體 松弛型復(fù)制控制的多拷貝質(zhì)粒。 一般情況下，當(dāng)培養(yǎng)基中氨基酸被耗盡，或是在細(xì)胞培養(yǎng)物中加入氯霉素以抑制蛋白質(zhì)的合成，寄主染色體DNA的復(fù)制便被抑制，細(xì)胞的生長(zhǎng)也隨之停止。 而松弛型質(zhì)粒DNA卻繼續(xù)復(fù)制數(shù)小時(shí)，使每個(gè)寄主細(xì)胞中ColE1質(zhì)粒的拷貝數(shù)達(dá)到10003000個(gè)，占細(xì)胞總DNA的50%左右。,3、pBR322質(zhì)粒載體 由三個(gè)不同來(lái)源的部分組成的： 第一部分來(lái)源于pSF2124質(zhì)粒易位子Tn3的氨芐青霉素抗性基因（AmpR）； 第二部分來(lái)源于pSC101質(zhì)粒的四環(huán)素抗性基因（tetr）； 第三部分則來(lái)源于ColE1的派

6、生質(zhì)粒pMB1的DNA復(fù)制起點(diǎn)（ori）。,AmpR,優(yōu)點(diǎn)是具有較小的分子量，其長(zhǎng)度為4 363bp。不僅易于純化，而且即使攜帶上一段6-8kb的外源DNA片段，操作起來(lái)仍較為便利。 具有兩種抗生素抗性基因以用作轉(zhuǎn)化子的選擇記號(hào)。有較高的拷貝數(shù)，若經(jīng)過(guò)氯霉素?cái)U(kuò)增，每個(gè)細(xì)胞中可累積10003000個(gè)拷貝，為重組體DNA的制備提供了極大的方便。,4、pUC質(zhì)粒載體（包括四個(gè)部分）： (i)來(lái)自pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)（ori）； (ii)氨芐青霉素抗性基因（ampr）； (iii)大腸桿菌-半乳糖酶基因（lacZ）的啟動(dòng)子及其編碼-肽鏈的DNA序列，此結(jié)構(gòu)特稱(chēng)為lacZ基因； (iv)位于lac

7、Z 基因中的靠近5-端的一段多克隆位點(diǎn)（MCS）區(qū)段，外源基因插入后破壞了lacZ 基因的功能。,優(yōu)點(diǎn)： 更小的分子量和更高的拷貝數(shù)。在pBR322基礎(chǔ)上構(gòu)建pUC質(zhì)粒載體時(shí)，僅保留下其中的氨芐青霉素抗性基因及復(fù)制起點(diǎn)，其分子小了許多，pUC8為2750bp，pUC18為2686bp。由于缺失rop基因，pUC質(zhì)粒不經(jīng)氯霉素?cái)U(kuò)增時(shí)，平均每個(gè)細(xì)胞即可達(dá)500700個(gè)拷貝。,可用組織化學(xué)方法檢測(cè)重組體。pUC8質(zhì)粒結(jié)構(gòu)中具有來(lái)自大腸桿菌lac操縱子的lacZ基因，所編碼的-肽鏈可參與-互補(bǔ)作用。因此，可用X-gal顯色法實(shí)現(xiàn)對(duì)重組體轉(zhuǎn)化子的鑒定。 具有多克隆位點(diǎn)MCS區(qū)段，可以把具兩種不同粘性末端

8、（如EcoRI和BamHI）的外源DNA片段直接克隆到pUC8質(zhì)粒載體上。,5、 pGEM-3Z質(zhì)粒 長(zhǎng)度為2743bp，編碼有一個(gè)氨芐青霉素抗性基因和一個(gè)lacZ基因。 含有兩個(gè)噬菌體啟動(dòng)子（T7和SP6），為RNA聚合酶的附著作用提供了特異性的識(shí)別位點(diǎn)。加入T7或SP6 RNA聚合酶，所克隆的外源基因便會(huì)轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的mRNA。,6、穿梭質(zhì)粒載體（shuttle plasmid vector） 指由人工構(gòu)建的具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇記號(hào)，可在兩種不同的寄主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。由于這類(lèi)質(zhì)粒載體可以保證外源DNA序列在不同物種的細(xì)胞之間得到擴(kuò)增，能在原核和真核細(xì)胞之間往返穿梭，具有廣泛

9、的用途。,7、pBluescript噬菌粒載體 pBluescript是指由Stratagene公司發(fā)展的一類(lèi)從pUC載體派生而來(lái)的噬菌粒載體，簡(jiǎn)稱(chēng)為pBS（+/-），如今則更多地叫作pBluescript KS（+/-）或pBluescript SK（+/-）。,SK表示多克隆位點(diǎn)區(qū)的取向，即lacZ基因是按照SacIKpnI的方向轉(zhuǎn)錄； （+/ -）表示單鏈?zhǔn)删wf1復(fù)制起點(diǎn)的兩種相反的取向。 f1（+）起點(diǎn)表示當(dāng)pBluescript噬菌粒載體和輔助噬菌體共感染寄主細(xì)胞時(shí)，能夠回收到lacZ基因的有意義鏈DNA；而f1（-）起點(diǎn)則表示當(dāng)pBluesript噬菌粒載體與輔助噬菌體共感染寄主

10、細(xì)胞時(shí)，可回收到lacZ基因的無(wú)意義鏈DNA。,(i)在多克隆位點(diǎn)區(qū)（MCS）的兩側(cè)，存在一對(duì)T3和T7噬菌體的啟動(dòng)子，用以定向指導(dǎo)插入在多克隆位點(diǎn)上的外源基因的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)； (ii)具有單鏈?zhǔn)删wM13或f1的復(fù)制起點(diǎn)和一個(gè)來(lái)自ColE1質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，保證pBluescript噬菌粒載體在有或無(wú)輔助噬菌體共感染的不同情況下，按照不同的復(fù)制形式分別合成出單鏈或雙鏈DNA；,(iii）編碼有一個(gè)氨芐青霉素抗性基因，作為轉(zhuǎn)化子克隆的選擇標(biāo)記； (iv)含有一個(gè)lacZ基因，可以按照X-gal-IPTG組織化學(xué)顯色法篩選噬菌粒載體的重組子。,LacZ編碼-半乳糖苷酶氨基端146個(gè)氨基酸的-肽， IPTG（異丙基- -D-硫代半乳糖苷）誘導(dǎo)該基因表達(dá)，合成的-半乳糖苷酶-肽能與宿主細(xì)胞所編碼的缺陷型-半乳糖苷酶相互補(bǔ)，產(chǎn)生有活性的-半乳糖苷酶，能水解外源加入培養(yǎng)基中的X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷），生成藍(lán)色的溴氯吲哚，使生長(zhǎng)于含X-gal培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)化菌落呈藍(lán)色。,重組DNA操作過(guò)程示意圖,圖5-2 DNA連接酶能把不同的DNA片段連接成一個(gè)整體,僅僅能在體外利用限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶進(jìn)行DNA的切割和重組，還不能滿(mǎn)足基因工程的要求，只有將它們連接到具備自主復(fù)制能力的DNA分子上，才能在寄主細(xì)