膜片鉗技術(shù)及應(yīng)用.ppt

1、膜片鉗技術(shù),細(xì)胞生物學(xué) 樊國(guó)達(dá) 學(xué)號(hào)： 2014年12月23日,膜片鉗技術(shù),向細(xì)胞內(nèi)注射恒定或變化的電流刺激，紀(jì)錄由此引起的膜電位的變化，這叫做電流鉗技術(shù)。在具體實(shí)驗(yàn)中，可通過(guò)給予細(xì)胞一系列電流脈沖刺激，誘發(fā)細(xì)胞產(chǎn)生動(dòng)作電位。,電壓鉗技術(shù)是通過(guò)向細(xì)胞內(nèi)注射一定的電流，抵消離子通道開(kāi)放時(shí)所產(chǎn)生的離子流，從而將細(xì)胞膜電位固定在某一數(shù)值。由于注射電流的大小與離子流的大小相等、方向相反。因此它可以反映離子流的大小和方向。,膜片鉗技術(shù),膜片鉗技術(shù)與電流鉗、電壓鉗技術(shù)在命名上并不完全一致，后兩者是從電學(xué)概念的角度命名的，而“膜片鉗”主要是從機(jī)械物理學(xué)的角度命名的。,膜片鉗技術(shù),從字面上理解，膜片鉗技術(shù)鉗制

2、的是“膜片”，是指采用尖端經(jīng)處理的微電極與細(xì)胞膜發(fā)生緊密接觸，使尖端下的這片細(xì)胞膜在電學(xué)上與其他細(xì)胞膜分離，這大大降低了背景噪聲，使單通道微弱的電流得以分辨出來(lái)。,膜片鉗技術(shù),所以，膜片鉗技術(shù)是一種通過(guò)微電極與細(xì)胞膜之間形成緊密接觸的方法，采用電壓鉗或電流鉗技術(shù)對(duì)生物膜上的離子通道的電活動(dòng)進(jìn)行記錄的微電極技術(shù)。膜片鉗技術(shù)是一種特殊的電壓鉗/電流鉗技術(shù)。,膜片鉗技術(shù),用特制的玻璃微吸管吸附于細(xì)胞表面，使之形成10100G的密封，被孤立的小膜片面積為m2量級(jí)，內(nèi)中僅有少數(shù)離子通道。然后對(duì)該膜片實(shí)行電壓鉗位，可測(cè)量單個(gè)離子通道開(kāi)放產(chǎn)生的pA量級(jí)的電流，這種通道開(kāi)放是一種隨機(jī)過(guò)程。通過(guò)觀測(cè)單個(gè)通道開(kāi)放

3、和關(guān)閉的電流變化，可直接得到各種離子通道開(kāi)放的電流幅值分布，并分析膜電位與離子濃度等之間的關(guān)系。,膜片鉗實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)雖然可因研究目的不同而有所區(qū)別，但其基本組成是相同的，包括膜片鉗放大器和接口，顯微鏡和視頻監(jiān)視器以及防震臺(tái)和屏蔽罩等。,倒置顯微鏡、防震臺(tái)、屏蔽罩、三維操縱儀,三維操縱儀,倒置顯微鏡,膜片鉗放大器,膜片鉗實(shí)驗(yàn)流程,膜片鉗實(shí)驗(yàn)方法包括： 制備玻璃微電極； 制備細(xì)胞標(biāo)本； 建立高阻封接； 電流記錄。,制備玻璃微電極,拉制微電極 材料：硼硅酸鹽毛細(xì)玻璃管。 要求：玻璃毛胚外徑1.31.7，內(nèi)徑1.01.2，壁的厚度在0.2以上。管壁越厚，拉制出的電極尖端管壁也越厚，電極的跨壁電容就越小，噪

4、聲也就越低。,玻璃微電極及膜片的幾何形狀,電極拉制儀,拉制方法：兩步拉制法。 第一步：使玻璃軟化，并拉開(kāi)一個(gè)距離，形成一個(gè)細(xì)管，即拉制電極的頸部； 第二步：使用較低的熱度，拉斷細(xì)管部，成為兩個(gè)基本相同的玻璃微電極，此步控制電極的尖端。一般拉制出的玻璃微電極尖端直徑為15m。,涂膠和拋光,對(duì)玻璃微電極進(jìn)行涂膠和拋光。 涂膠（疏水性涂料，如硅酮樹(shù)脂）主要是為了減小電極的跨壁電容。,拋光儀,拋光是指將玻璃微電極靠近加熱的鉑絲，從而使電極尖端變光滑的過(guò)程。拋光主要目的是。防止電極尖端刺破細(xì)胞，利于高阻封接。,電極液的充灌,對(duì)于尖端較細(xì)的玻璃微電極，膜片鉗實(shí)驗(yàn)中常用的方法是：在微電極尾部施加負(fù)壓使尖端充

5、灌電極內(nèi)液，然后用注射器在微電極尾部充灌電極內(nèi)液，最后輕彈微電極桿步使其內(nèi)的氣泡排出。 充灌長(zhǎng)度為電極的1/3。,制備細(xì)胞標(biāo)本,從理論上來(lái)講，膜片鉗實(shí)驗(yàn)用的細(xì)胞標(biāo)本可來(lái)自體內(nèi)各種組織細(xì)胞，只要細(xì)胞表面光滑，能與微電極尖端形成高阻封接即可。但在標(biāo)本制備上，不同組織細(xì)胞間聯(lián)接牢固程度不同，采用的分離方法也不完全相同。大體上包括沖洗、酶解消化或機(jī)械分離以及清洗等步驟。,建立高阻封接,在顯微鏡下找到微電極，移動(dòng)三維操縱儀，使電極尖端接觸細(xì)胞，形成高阻封接。,建立高阻封接,高阻封接形成是進(jìn)行膜片鉗實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵一步。微電極尖端與細(xì)胞膜形成封接的過(guò)程，可以采用軟件發(fā)出1mV脈沖電壓作用于微電極，造成膜兩側(cè)電位

6、差發(fā)生變化，產(chǎn)生電極電流，再通過(guò)顯示屏，觀察電極電流幅度的變化來(lái)確定封接程度。在電極未入溶液之前，在顯示器上可見(jiàn)一直線。,高阻封接形成的電流圖,膜片鉗技術(shù)四種基本記錄模式,細(xì)胞吸附膜片(cell-attachedpatch) 將兩次拉制后經(jīng)加熱拋光的微管電極置于清潔的細(xì)胞膜表面上，形成高阻封接，在細(xì)胞膜表面隔離出一小片膜，既而通過(guò)微管電極對(duì)膜片進(jìn)行電壓鉗制，高分辨測(cè)量膜電流，稱(chēng)為細(xì)胞貼附膜片。由于不破壞細(xì)胞的完整性，,全細(xì)胞記錄法(Whole-cell recording) 在高阻抗封接做好后，再給一個(gè)很小的負(fù)壓，將電極覆蓋的膜吸破，使電極內(nèi)與整個(gè)細(xì)胞內(nèi)相通，用這個(gè)方法可記錄進(jìn)出整個(gè)細(xì)胞的電流

7、。,內(nèi)面向外膜片(inside-outpatch) 高阻封接形成后，在將微管電極輕輕提起，使其與細(xì)胞分離，電極端形成密封小泡，在空氣中短暫暴露幾秒鐘后，小泡破裂再回到溶液中就得到“內(nèi)面向外”膜片。,外面向外膜片（Outside-out patch ） 在全胞記錄式的基礎(chǔ)上，拉開(kāi)電極使之與胞體脫離，這是附在電極尖端的膜片又可自動(dòng)地將電極尖端口封住。此膜片的外側(cè)面向外其是在全細(xì)胞記錄的基礎(chǔ)上改進(jìn)而成。,膜片鉗技術(shù)的應(yīng)用,2008年，第二軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部生物物理研究所的研究人員采用膜片鉗和激光掃描共聚焦顯微鏡，同步實(shí)時(shí)系統(tǒng)觀察心肌細(xì)胞鈣離子的釋放。,基本原理,膜片鉗能獲得膜上鈣離子通道的離子電流，但不能對(duì)離子的移動(dòng)進(jìn)行實(shí)時(shí)定位， 不能定量分析離子濃度。激光掃描共聚焦顯微鏡可以對(duì)鈣離子的移動(dòng)進(jìn)行實(shí)時(shí)定位, 但無(wú)法對(duì)單個(gè)離子通道的離子移動(dòng)信號(hào)( 如單通道電流)進(jìn)行分析。,大鼠心室肌細(xì)胞 L2型鈣通道電流(IC