新型AH1N1流感病毒的分子生物學(xué)特征

1、新型 A/H1N1流感病毒的分子生物學(xué)特征流行性感冒簡(jiǎn)稱流感，是由A 、B、 C 三種流感病毒引起的急性呼吸道傳染病。A 型流感病毒根據(jù)其表面血凝素HA 和神經(jīng)氨酸酶 NA 基因的不同又可分成16 個(gè) HA 亞型 (H1-H16)和 9 個(gè) NA 亞型 (N1-N9) 。豬流感是一種由A 型流感病毒引起的豬呼吸系統(tǒng)疾病。今年3 月份由墨西哥發(fā)端的流感疫情目前已蔓延至36 個(gè)國家和地區(qū)，其中18 個(gè)國家已有確診病例，2 個(gè)國家有患者死亡。根據(jù)疫情病原體的基因組特征，其屬于新型H1N1 亞型豬流感病毒，世界衛(wèi)生組織（ WHO ）稱之為豬流感。雖然這種新型病毒是由豬流感病毒演變而來，但到目前為止這種

2、病毒只導(dǎo)致人類患病，并在人與人之間傳播，而豬感染僅發(fā)現(xiàn)一個(gè)病例，也沒有有力證據(jù)證明本次流感疫情是從由豬傳播開來的。因此，4 月 30 日 WHO 將本次疫情改稱為 /H1N1 型流感，不再使用 “豬流感 ”一詞。一、基因特征屬于豬流感病毒利用流感病毒信息庫和快速分析平臺(tái)，對(duì)已報(bào)道的22株在病毒序列進(jìn)行分析，各地分離株的核苷酸 序列的同源性達(dá)到 99%以上，屬于同一株病毒。對(duì)HA 基因和 NA 基因進(jìn)行分析, 確認(rèn)引起本次疫情的病原體屬于A/H1N1 亞型流感病毒。 同時(shí)對(duì)整個(gè)病毒的8 條基因進(jìn)行進(jìn)一步分析， 發(fā)現(xiàn)此次流行的病毒株包含一種較為獨(dú)特的基因片段組合，是來自北美和歐亞兩種豬流感病毒的混

3、合體， 但并未發(fā)現(xiàn)其具有典型的人流感和禽流感病毒特征。先前報(bào)道的本次新型流感病毒集中呈現(xiàn)了豬流感病毒、人流感病毒和禽流感病毒的特征，是來自豬、人和禽類等多物種來源的流感病毒雜交體的說法值得商榷。1.HA 基因本次流行的流感毒株的HA 基因核苷酸序列與早期從美國分離到的H1N2 的豬流感病毒株 的 的 同 源 性 達(dá) 到93% 以 上 ， 其 中 與 印 第 安 納 州 的H1亞 型 豬 流 感 病 毒(A/Swine/Indiana/P12439/00 (H1N2) 具有95%的同源性。提示本次A/H1N1 流感病毒的 HA基因由北中美洲本地的豬流感病毒變異而來。2.NA 和 M 基因NA基因

4、沒有發(fā)生核苷酸缺失，其序列具有歐亞株系豬流感病毒的特征，同源性在90%以上的病毒都是來源于歐亞地區(qū)的H1N1豬流感病毒，其中與A/Swine/England/195852/92(H1N1),A/swine/Spain/WVL6/1991(H1N1)的核苷酸同源性達(dá)到了94%。M 基因的核苷酸序列也與歐亞株系的豬流感病毒的同源性最高，達(dá)到96%。提示 NA 和 M 基因來源于歐亞株系的豬流感病毒。3.其它基因PB1 、PB2、 NP、 NS 基因的核苷酸序列與美韓等國分離到的豬流感病毒的同源性最高，達(dá)到 96%；PA 基因的核苷酸序列與美國本土分離到的豬流感病毒的同源性最高，達(dá)到 96%。其中

5、PB2 和 PA 基因與 2007 年部分從南達(dá)科他州分離到的H3N2 禽流感病毒的同源性也有96%。這種來自北中美和歐亞兩種豬流感病毒的混合體是一種新型的A/H1N1病毒，以前從未發(fā)現(xiàn)這種重組病毒在豬群中感染和流行，也從未在美國以及其它國家的豬流感和人流感病毒分離株中出現(xiàn)中， GenBank 中也未有類似基因組合的病毒序列的報(bào)道。歐亞豬流感病毒通常僅在歐亞流行， 還沒有報(bào)道說在人體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)過， 人體對(duì)這種病毒缺乏免疫保護(hù)作用， 這可能是此病毒快速傳播的原因之一。這種具有典型豬流感病毒特征的重組病毒組合如何而來，如何傳染到人體，為何僅在人與人之間傳播而豬中卻未發(fā)現(xiàn)，這一系列問題還未能解釋。雖然

6、到目前為止來自疫情發(fā)源地墨西哥的病毒樣本還沒有全序列可供參考，但是來之各地分離到的新型 A/H1N1 病毒的全序列同源性達(dá) 99%以上，可以相信造成墨西哥以及全球流感疫情的病原體是同一種病毒。1 / 4二、具備人與人之間傳播能力豬流感病毒通常暴發(fā)于生豬當(dāng)中，多見于秋季末期和冬季，發(fā)病率較高，病死率較低。目前，已從豬身上分離主要的流感病毒主要有H1N1 、H1N2 、H3N2 三種亞型。人類一般不會(huì)患上豬流感，人感染豬流感病例多見與生豬接觸的人員。歷史上出現(xiàn)過一次豬流感疫情，1976 美國新澤西州迪克斯堡的士兵中出現(xiàn)豬流感爆發(fā)，200 多人患病 1 人死亡。但 2005 年12 月至 2009

7、年 2 月期間，美國總共僅報(bào)道了12 例人感染豬流感病例，但均未出現(xiàn)死亡，表明現(xiàn)有豬群間流行的豬流感病毒流感對(duì)人類的危害有限。但是，本次流感疫情的蔓延如此迅速，顯示新型A/H1N1 病毒具有較強(qiáng)的傳染性。美國和墨西哥的患者絕大多數(shù)并未接觸過豬，并且在豬中也未分離到該種毒株，僅在人群之間感染和發(fā)病，表明這種病毒已是由人-人形式傳播，但是這種病毒在人際間傳播的能力尚有待進(jìn)一步評(píng)價(jià)。流感病毒的傳播主要取決于HA 蛋白的受體結(jié)合特異性，位于HA 蛋白頭部的受體結(jié)合位點(diǎn)（ RBS），其主要由190 位螺旋、 130 位環(huán)和 220 位環(huán) 3 個(gè)結(jié)構(gòu)域組成。我們對(duì)7 株美國分離到的毒株的 HA基因進(jìn)行分析

8、，發(fā)現(xiàn)其HA 蛋白的 226位為 Q， 228 位為 G，具備H1 亞型病毒典型的結(jié)合人樣受體的特征。190 位螺旋（ 190-198位）：DQQSL YQNA和 130位環(huán)（ 135-138 位）：VTAA 的相關(guān)氨基酸與美國流行的豬流感病毒相一致；220 位環(huán)（ 221-228位）：PKVRDQEG ，其 225 位的 D 和 227 位的 E 與美國大部分的豬流感病毒分離株不一致，僅與 06 年美國 Ohio 分離株相一致，但與人H1 亞型病毒的氨基酸完全一致性，提示新型A/H1N1 流感病毒蛋白的受體結(jié)合特異性完全符合感染人類的要求，具備人傳播人的分子基礎(chǔ)的。進(jìn)一步分析 HA 的裂解位

9、點(diǎn)序列為PSIQSRGLFGAI ，具有典型 H1亞型的病毒特征，可 被存 在 于 人 呼 吸 道 細(xì) 胞 的 某 些 特 定 的 蛋 白 酶 , 如 : 胰 蛋 白 酶 、 跨 膜 絲 氨 酸 蛋 白 酶2/4(TMPRSS2/4 ）、人氣道胰蛋白酶樣蛋白酶（HAT ）等所切割，利于病毒的復(fù)制增殖，引起呼吸系統(tǒng)感染。三、致病能力分析HA 的糖基化，特別是頭部RBS 或抗原決定區(qū)附近的糖基化位點(diǎn)的增加或減少對(duì)病毒的抗原性及其生物學(xué)特性均有一定作用。受體結(jié)合位點(diǎn)的糖基化會(huì)影響病毒與受體的結(jié)合能力，抗原決定位點(diǎn)附近的糖基化則影響機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性的中和抗體，在裂解位點(diǎn)出現(xiàn)糖基化位點(diǎn)能直接影響 HA 蛋

10、白的裂解。分析本次 A/H1N1流感病毒的 HA 基因，其第98、 153、183、190、194、225 位的氨基酸分別為Phe、Trp、His、Asp 、Leu，與其它來源的流感病毒一樣呈現(xiàn)高度保守，保證受體結(jié)合區(qū)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。HA 蛋白序列上共有 8 個(gè)糖基化位點(diǎn)，6 個(gè)位于 HA1 區(qū)的第 13、 14、26、 90、 279、290 位 N 上， 2 個(gè)位于 HA2 區(qū)第 154、213 位N 上。 HA 蛋白 158 位無額外的糖基化位點(diǎn)，同時(shí)NA 蛋白的頸部無氨基酸缺失的，這一組合在 H5N1 亞型流感病毒的研究中顯示已出很強(qiáng)的致病力。進(jìn)一步分析 HA 的裂解位點(diǎn)序列為PSIQS

11、R GLFGAI，與典型 H1N1 亞型病毒在 HA 切割位點(diǎn)處的氨基酸序列相一致，尚未出現(xiàn)高致病性毒株的分子特征（RXR/KRGLF），僅可被存在于宿主呼吸道或消化道細(xì)胞的某些特定的蛋白酶和某些細(xì)菌酶識(shí)別并裂解，引起呼吸道或消化道的局部感染。但同樣，1918年的西班牙流感的 H1N1 病毒株的 HA 裂解位點(diǎn)序列也為 PSIQSRGLFGAI ，沒有插入多個(gè)堿性氨基酸，但致病性非常強(qiáng)，其本身的NA 蛋白和HA 的裂解有關(guān)，其中的機(jī)制還不清楚。因此低致病性流感病毒不僅能通過HA 的突變?cè)鰪?qiáng)毒力并且還能通過 NA 的突變?cè)鰪?qiáng)毒力。PB2 的 627 位氨基酸是 A 型流感病毒宿主范圍以及病毒致病

12、力的重要決定位點(diǎn)，當(dāng)627位為為 K 時(shí)毒株致病力強(qiáng)，更適合于感染人類；627 位為 E 時(shí)毒株致病力弱。本次A/H1N1流感病毒 PB2 的 627 位仍然保留致病力弱的為較弱的E。另外， 本次 A/H1N1 流感病毒是來自北美和歐亞兩種豬流感病毒的混合體，人類從未感染過此類病毒，機(jī)體對(duì)該病毒缺乏免疫2 / 4保護(hù)能力， 從而顯示出其較強(qiáng)的致病能力。但目前還沒有看到超級(jí)傳播的現(xiàn)象發(fā)生，提示此次病毒的傳播能力可能有限，可以獲得有效防控。四、對(duì)藥物敏感性的分析目前針對(duì)季節(jié)性的抗流感病毒藥物主要有兩類。一類是M2 離子通道抑制劑：金剛烷胺（Amantadine ）和金剛乙胺（Amantadine

13、）；另一類是神經(jīng)氨酸酶抑制劑：達(dá)菲（奧塞米韋，Oseltamivir ）和扎那米韋（Zanamivir ）。1.對(duì) M2 離子通道抑制劑耐藥流感病毒的耐藥與抗病毒藥物的使用具有非常大的關(guān)聯(lián)性。最近全球多個(gè)國家感染新型A/H1N1 病毒的患者已對(duì)金剛烷胺（Amantadine ）和金剛乙胺（Rimantadine ）耐藥。金剛烷胺類藥物對(duì) A 型流感病毒的 M2 蛋白質(zhì)具有阻礙功能作用， 而對(duì) B 型則無效。 M2 蛋白質(zhì)形成 4 聚體，在酸性環(huán)境下活化離子通道而發(fā)揮作用。而金剛烷胺則通過抑制這種M2 離子通道的功能而抑制病毒增殖。與流感病毒耐藥有關(guān)的突變主要位于M2 跨膜區(qū)域的部分氨基酸，現(xiàn)已

14、證實(shí)L26F 、 V27A 、 A30T 、 S31N、 G34E位中的氨基酸只要有一個(gè)或一個(gè)以上的變異就會(huì)導(dǎo)致耐藥株的出現(xiàn)，特別是S31N 的變異最為多見。該區(qū)域是金剛烷胺類藥物的作用靶點(diǎn)， 一旦氨基酸發(fā)生改變，導(dǎo)致產(chǎn)生高水平的耐藥性。對(duì)本次 A/H1N1病毒分析發(fā)現(xiàn)，其 M2 基因的31 位點(diǎn)的氨基酸突變?yōu)镹，具備耐藥的分子基礎(chǔ)。目前各亞型流感病毒對(duì)金剛烷胺的耐藥普遍存在，有報(bào)道稱 H3N2 亞型的耐藥株會(huì)在金剛烷胺治療2 天后從病人體內(nèi)分離到。 由于金剛烷胺類藥物極其容易產(chǎn)生廣泛的耐藥性，提示其可能已不適合作為流感病毒的預(yù)防和治療用藥。2、對(duì)神經(jīng)氨酸酶酶抑制劑敏感臨床報(bào)道的NA 抑制劑抗

15、性的產(chǎn)生，與使用的藥物的不同而有所不同。通過達(dá)菲治療以后，能夠產(chǎn)生R292K 、 E119V 、 D198N 和 H274Y 等突變。而通過扎那米韋治療以后，只產(chǎn)生 R152K 的突變。病毒突變的發(fā)生存在著型特異性，例如，H274Y 主要存在于 N1亞型中，R292K 和 E119V 主要存在于 N2 亞型中， R152K 和 D198N主要存在于B 型流感病毒中。A/H3N2 和 A/H1N2 對(duì)達(dá)菲比扎那米韋更為敏感， 而 A/H1N1和 B 型流感病毒， 則正好相反。達(dá)菲對(duì)抑制 N1 、 N4、 N5 和 N8 亞型的流感病毒具有較好的效果，而扎那米韋對(duì)抑制N2 、N3 、N6 、N7

16、和 N9 亞型的流感病毒 NA 活性具有更好的潛力。通過體外實(shí)驗(yàn)和反向遺傳技術(shù)的實(shí)驗(yàn)表明，N2 亞型的流感病毒的抗性與某些氨基酸是相關(guān)聯(lián)的，R152K 的突變能夠引起 B 型流感病毒抗性的產(chǎn)生，而不能夠使N2 亞型的流感病毒產(chǎn)生抗性。在N1 亞型的流感病毒中，只有H274Y 的突變能夠從體內(nèi)和體外獲得，而卻沒有在N2亞型的流感病毒中發(fā)生。盡管存在著藥物使用產(chǎn)生的特異性和亞型的特異性，許多的催化氨基酸的突變導(dǎo)致了交叉抗性， 框架氨基酸的突變 （例如 E119G）導(dǎo)致了對(duì)扎那米韋抗性的產(chǎn)生，但是保持了對(duì)達(dá)菲的敏感性；然而 E119V 的突變導(dǎo)致了對(duì)達(dá)菲的抗性的產(chǎn)生。在N1亞型的流感病毒中的H274

17、Y 突變，只對(duì)達(dá)菲抗性的產(chǎn)生起作用，而并不產(chǎn)生對(duì)扎那米韋的抗性。對(duì)本次 A/H1N1病毒分析發(fā)現(xiàn)，其 274 位未發(fā)生由 H 到 Y 的突變，提示達(dá)菲等神經(jīng)氨酸酶抑制劑類藥物依然有效，這與臨床的治療效果相一致。五、抗 H1N1 常規(guī)疫苗是否有效目前針對(duì)豬流感病毒的疫苗只有用于豬的，還沒有專門用于人類的。本次流行的 A/H1N1是一種全新的流感病毒，屬于北中美和歐亞株系豬流感病毒的混合體，從歷史上看人類極少感染這兩個(gè)株系的豬流感病毒，因此機(jī)體對(duì)該病毒缺乏免疫保護(hù)能力。目前使用的季節(jié)性流感疫苗都是在已知流感病毒中選取組成，由于人類季節(jié)性流感疫苗和豬流感在抗原性和基因上不一樣， 所以推測(cè)目前的流感疫苗不能有效預(yù)防本次流感疫情。有報(bào)道稱在已完成的動(dòng)物試驗(yàn)表明目前的疫苗對(duì)于正在全球肆虐的A/H1N1 型豬流感病毒沒有效果。我們通過比較疫苗采用病毒株和新型A/H1N1 病毒株的 HA 抗原決定區(qū)氨基酸序列，來3 / 4評(píng)價(jià)其交叉保護(hù)性。H1 亞型流感病毒HA 蛋白的球狀頭部具有5 個(gè)