透射電子顯微鏡

1、透射電子顯微鏡. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?）掌握透射電鏡的基本構(gòu)成（2）掌握透射電鏡的成像原理（3）了解透射電鏡的操作過程（4）了解生物樣品的制備過程（5）利用透射電鏡觀察納米材料和生物樣品. 儀器及技術(shù)指標(biāo)（1）型號：Hitachi（日立）-7650型透射電鏡（2）加速電壓：40kV 120kV（3）放大倍數(shù)：200 60萬倍圖1 Hitachi-7650型透射電鏡. 透射電鏡的基本構(gòu)成透射電子顯微鏡（Transmission Electron Microscope，TEM），簡稱透射電鏡，是以波長很短的電子束做照明源，用電磁透鏡聚焦成像的一種具有高分辨本領(lǐng)、高放大倍數(shù)的電子光學(xué)儀器。圖2透射電鏡剖面結(jié)

2、構(gòu)示意圖1. 電子光學(xué)系統(tǒng)：又稱鏡筒，是TEM的核心。發(fā)射并使電子加速的電子槍（1）照明部分： 會聚電子束的聚光鏡電子束平移、傾斜調(diào)節(jié)裝置作用：提供亮度好、相干性好、束流穩(wěn)定的照明電子束。 物鏡 中間鏡（2）成像部分： 投影鏡 物鏡光闌 選區(qū)光闌 穿過試樣的透射電子束在物鏡后焦面上成衍射花樣，在物鏡像平面上成放大的組織像，并經(jīng)過中間鏡、投影鏡的接力放大，獲得最終的圖像。 熒光屏（3）觀察記錄部分 照相機(jī) 試樣圖像經(jīng)過透鏡多次放大后，在熒光屏上顯示出高倍放大的像。2. 真空系統(tǒng)： 電子光學(xué)系統(tǒng)的工作過程要求在真空條件下進(jìn)行，這是因?yàn)樵诔錃獾臈l件下會發(fā)生以下情況： 柵極與陽極間的空氣分子電離，導(dǎo)致

3、高電位差的兩極之間放電 熾熱燈絲迅速氧化，無法正常工作 電子與空氣分子碰撞，影響成像質(zhì)量 試樣易于氧化，產(chǎn)生失真目前，一般TEM的真空度為10-5 Torr（1Torr133.32Pa）左右。真空泵組經(jīng)常由機(jī)械泵和擴(kuò)散泵兩級串聯(lián)成。為了進(jìn)一步提高真空度，可采用分子泵、離子泵，真空度可達(dá)10-8 Torr或更高。3. 電源與控制系統(tǒng)： 電子槍加速電子用的小電流高壓電源 用于提供兩部分電源 透射激磁用的大電流低壓電源. 透射電鏡的成像原理：1. TEM是依照阿貝成像原理工作的平行入射波受到有周期性特征物體的散射作用在物鏡的后焦面上形成衍射譜，各級衍射波通過干涉重新在像平面上形成反映物的特征的像。2

4、. 具體過程：電子槍產(chǎn)生的電子束經(jīng)12級聚光鏡后均勻照射到試樣上的某一待觀察微小區(qū)域上，入射電子與試樣物質(zhì)相互作用，由于試樣很薄，絕大部分電子穿透試圖3阿貝成像原理圖樣，其強(qiáng)度分布與所觀察試樣區(qū)的形貌、組織、結(jié)構(gòu)一一對應(yīng)。透射出試樣的電子經(jīng)過物鏡、中間鏡、投影鏡的三級磁透鏡放大投射在觀察圖形的熒光屏上，熒光屏把電子強(qiáng)度分布轉(zhuǎn)變?yōu)槿搜劭梢姷墓鈴?qiáng)分布，于是在熒光屏上顯示與試樣形貌、組織、結(jié)構(gòu)相對應(yīng)的圖像。 根據(jù)阿貝成像原理，穿過試樣的透射電子束：在物鏡像平面成放大的組織像，故TEM可做形貌分析在物鏡后焦面成衍射花樣，故TEM可做物相分析并經(jīng)過中間鏡、投影鏡的接力放大，獲得最終的圖像。. 透射電鏡的

5、操作過程1. 開機(jī) （1）打開循環(huán)水裝置開關(guān)至“ON”。 （2）主機(jī)啟動：順時(shí)針旋轉(zhuǎn)主機(jī)開關(guān)鑰匙至“EVAC ON”，待機(jī)械泵啟動后，再將鑰匙順時(shí)針轉(zhuǎn)至“COL ON”啟動計(jì)算機(jī)。 （3）等主機(jī)啟動后約30分鐘，“EVAC”指示燈由閃爍變綠后（說明真空已抽好），開始進(jìn)行電鏡觀察。2. 電鏡觀察 （1）裝樣品： 將樣品桿水平向外拉出，碰到第一次阻止時(shí)稍向順時(shí)針方向（15）旋轉(zhuǎn)，碰到第二次阻止，接著水平向外拉，直到碰到第三次阻止，再逆時(shí)針（45）旋轉(zhuǎn)，碰到第四次阻止時(shí)，樣品外室控制開關(guān)指示燈亮，變紅色，按下開關(guān)至“OFF”，待指示燈滅后，水平拔出樣品桿。 將樣品桿頭部樣品安裝槽上的墊片取下，用尖頭

6、鑷子夾取一個裝有切片的銅網(wǎng)放入安裝槽內(nèi)，裝上墊片，固定好，仔細(xì)檢查有無松動現(xiàn)象。 將樣品桿水平插入樣品室，待樣品外室控制開關(guān)指示燈亮?xí)r，將開關(guān)轉(zhuǎn)向“ON”的位置，待指示燈變綠色時(shí)，將樣品桿沿著上述反方向送入樣品室。（2）加高壓：點(diǎn)擊電腦屏幕對話框中“HV ON”按鈕，加高壓至80 kV。待高壓穩(wěn)定后，打開燈絲運(yùn)行對話框，按“ON”加燈絲電壓，接通燈絲電流。（3）調(diào)光：熒光屏出現(xiàn)亮斑后進(jìn)行電子束對中調(diào)整，并使亮斑均勻發(fā)散為止。 按下“LENS”鍵，將光路恢復(fù)到初始狀態(tài)。 轉(zhuǎn)動“BRIGHT”旋鈕，將亮斑調(diào)小。按下“BH”鍵，同時(shí)配合使用左右兩邊的萬能調(diào)節(jié)旋鈕，將亮斑調(diào)至熒光屏中央（使亮斑以熒光屏

7、中央的十字叉“+”為圓心）。按下“CS”鍵，同時(shí)配合使用左右兩邊的萬能調(diào)節(jié)旋鈕，將亮斑調(diào)成圓形。（上述過程中，“BH”鍵和“CS”鍵可反復(fù)交替使用，直至將亮斑調(diào)至熒光屏中央，并成圓形） 轉(zhuǎn)動“BRIGHT”旋鈕，使亮斑均勻散開。再通過調(diào)節(jié)聚光鏡光闌旁邊的兩個小旋鈕，使得到的亮圓與熒光屏形成同心圓。（4）調(diào)樣品： 將樣品桿完全推入樣品室，此時(shí)在熒光屏上看到銅網(wǎng)的像。找到銅網(wǎng)支持膜上有樣品的位置，轉(zhuǎn)動“MAG”旋鈕，將放大倍數(shù)調(diào)至20 K倍（即2萬倍）。 按下“WOB”鍵，樣品開始振動（樣品高度引起）。按下“SPOT”鍵，1個小的放大鏡出現(xiàn)在熒光屏的中央（用于觀察樣品振動細(xì)節(jié)）。此時(shí)借助放大鏡，調(diào)

8、節(jié)樣品高度，直到樣品不發(fā)生振動為止。 按下“MODU”鍵，樣品又開始振動（光引起）。此時(shí)仍借助放大鏡，并使用左右兩邊的萬能調(diào)節(jié)旋鈕，將樣品調(diào)至不發(fā)生振動。最后，按下“SPOT”鍵，將放大鏡退出。（5）增加樣品反差： 找到銅網(wǎng)支持膜上有樣品的位置，按下“DIFF”鍵（此時(shí)由圖像模式變換至衍射模式），旋轉(zhuǎn)物鏡光闌旋鈕，選擇合適的物鏡光闌孔，同時(shí)調(diào)節(jié)物鏡光闌旁邊的兩個小旋鈕，用物鏡光闌孔將中心最亮的衍射斑點(diǎn)套?。ㄊ棺盍裂苌浒唿c(diǎn)成為物鏡光闌孔的圓心）。 按下“ZOOM1”鍵，此時(shí)又由衍射模式變換到圖像模式。（6）拍照： 選定所要拍照的區(qū)域，轉(zhuǎn)動“BRIGHT”旋鈕，將光調(diào)暗。用蓋子蓋上觀察室，在電腦屏

9、幕上進(jìn)行操作，用CCD相機(jī)進(jìn)行觀察。 在電腦屏幕上觀察樣品的形貌，通過轉(zhuǎn)動“FOCUS”旋鈕，觀察樣品在正焦、過焦和欠焦時(shí)所得圖像的清晰度情況。 經(jīng)過精確調(diào)焦后（在稍欠焦的狀態(tài)下拍得的圖像最好），拍照并保存記錄。在拍照過程中要注意左右手的配合，同時(shí)將放大倍數(shù)、亮度、樣品臺移動、調(diào)焦等一系列動作密切協(xié)調(diào)，以達(dá)到最佳的觀察效果。 （7）關(guān)機(jī)： 將燈絲電流關(guān)閉，再將高壓關(guān)閉，放大倍數(shù)復(fù)位（3K倍左右），然后退出物鏡光闌，將樣品從樣品桿中取出。 將主機(jī)電源鑰匙向逆時(shí)針轉(zhuǎn)一格，先關(guān)閉計(jì)算機(jī)。等計(jì)算機(jī)關(guān)閉后，繼續(xù)逆時(shí)針轉(zhuǎn)一格，關(guān)閉主機(jī)電源。 約等30分鐘后，機(jī)械泵完全停止工作（“EVAC”和“AIR”指示

10、燈都熄滅），此時(shí)關(guān)閉循環(huán)水裝置，切斷總電源。3. 緊急處理： （1）在觀察過程中遇到意外情況時(shí)，必須停止操作，并通知電鏡室負(fù)責(zé)人，待意外情況排除后，得到電鏡室負(fù)責(zé)人同意方能繼續(xù)觀察。 （2）遇到突然停電，首先將主機(jī)電源開關(guān)關(guān)閉，約等30分鐘后關(guān)閉循環(huán)水。. 透射電鏡的應(yīng)用1. 利用透射電鏡觀察納米材料 圖4納米Au棒（左）和納米三角Ag顆粒（右）的TEM照片2 利用透射電鏡觀察生物樣品 生物樣品的制備過程：圖5生物樣品的制備過程（1）取材：1 mm3 將取出的組織放在潔凈的蠟版上，滴一滴預(yù)冷的固定液，用兩片新的、鋒利的刀片成“拉鋸式”將組織切下并修小，然后用牙簽或鑷子將組織塊移至盛有冷的固定液

11、的小瓶中。 此過程中要做到“快、小、準(zhǔn)、冷” （2）固定： 目的是盡可能使細(xì)胞中的各種細(xì)胞器以及大分子結(jié)構(gòu)保持生活狀態(tài)，并且牢固地固定在它們原來所在的位置上。 物理 化學(xué)：化學(xué)試劑 四氧化鋨 戊二醛 （3）脫水： 保證包埋介質(zhì)完全滲入組織內(nèi)部。 脫水劑 乙醇 丙酮 為了避免急驟脫水引起細(xì)胞的收縮，脫水應(yīng)梯度進(jìn)行。如：70 丙酮15分鐘，80 丙酮15分鐘，90 丙酮15分鐘，100 丙酮10分鐘（二次）。 （4）包埋： 常用的包埋劑：環(huán)氧樹脂 利用包埋劑滲入到組織內(nèi)部取代脫水劑，這種包埋劑在聚合前為液體，能夠滲入組織內(nèi)，當(dāng)加入某些催化劑，并經(jīng)加溫后，能聚合成固體，以便進(jìn)行超薄切片。 常規(guī)方法是

12、將組織塊包埋在多孔橡膠包埋模板中，然后置烘箱烘干，在45（12小時(shí)）、60（36小時(shí)）烘箱內(nèi)加溫，即可聚合硬化，形成包埋塊。圖6 包埋模版 （5）超薄切片： 采用超薄切片機(jī)將包埋塊進(jìn)行切片，得到5070nm的超薄切片。 圖7 Leica超薄切片機(jī) （6）染色： 目的是為了增強(qiáng)樣品的反差。一般用重金屬鹽與組織細(xì)胞中某些成分結(jié)合或被組織吸附來達(dá)到染色的目的。 染色劑 醋酸鈾 檸檬酸鉛 （7）電鏡觀察、拍片、記錄等。圖8花粉細(xì)胞的TEM照片. 參考書目：（1）黃孝瑛 透射電子顯微學(xué) 上海科學(xué)技術(shù)出版社，1987年（2）葉恒強(qiáng)、王元明 透射電子顯微學(xué)進(jìn)展科學(xué)出版社，2003年（3）章曉中 電子顯微分析 清華大學(xué)出版