DNA濃度和純度的測(cè)定

1、DNA濃度和純度的測(cè)定一、原理DNA或RNA鏈上堿基的苯環(huán)結(jié)構(gòu)在紫光區(qū)具有較強(qiáng)吸收，其吸收峰在260nm處。波長(zhǎng)為260nm時(shí)，DNA或RNA的光密度OD260不僅與總含量有關(guān)，也隨構(gòu)型而有差異。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品來(lái)說(shuō)，濃度為1g / ml時(shí)，DNA鈉鹽的OD2600.02當(dāng)OD2601時(shí)，dsDNA濃度約為50g / ml ssDNA濃度約為37g / ml RNA濃度約為40g / ml 寡核苷酸濃度約為30g / ml（youyu底物不同有差異）當(dāng)DNA樣品中含有蛋白質(zhì)、酚或其他小分子污染物時(shí)，會(huì)影響DNA吸光度的準(zhǔn)確測(cè)定。一般情況下同時(shí)檢測(cè)同一樣品的OD260、OD280和OD230，計(jì)算其比

2、值來(lái)衡量樣品的純度。經(jīng)驗(yàn)值：純DNA：OD260 / OD2801.8 (1.9,表明有RNA污染；1.6，表明有蛋白質(zhì)、酚等污染） 純RNA：1.7 OD260 / OD2802.0 （1.7時(shí)表明有蛋白質(zhì)或酚污染；2.0時(shí)表明可能有異硫氰酸殘存）若樣品不純，則比值發(fā)生變化，此時(shí)無(wú)法用分光光度法對(duì)核酸進(jìn)行定量，可使用方案二的方法或其他方法進(jìn)行估算。 二、材料、試劑及器具1、 材料提取的PUC19樣品、PUC19標(biāo)準(zhǔn)樣品2、 試劑滅菌重蒸水，TE緩沖液3、 器皿石英比色皿；UV-240紫外分光光度計(jì)二、實(shí)驗(yàn)步驟1、 UV-240紫外分光光度計(jì)開機(jī)預(yù)熱10min.2、 用重蒸水洗滌石英比色皿，吸

3、水紙吸干，加入TE緩沖液后，放入樣品室的S池架上，關(guān)上蓋板。3、 設(shè)定狹縫后校零。4、 將標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測(cè)樣品適當(dāng)稀釋（DNA 5l或RNA 4l用TE緩沖液稀釋至1000l）后，記錄編號(hào)和稀釋度。5、 把裝有標(biāo)準(zhǔn)樣品或待測(cè)樣品的比色皿放進(jìn)樣品室的S架上，關(guān)閉蓋板。6、 設(shè)定紫外光波長(zhǎng)，分別測(cè)定230nm、260nm、280nm波長(zhǎng)時(shí)的OD值。7、 計(jì)算待測(cè)樣品的濃度與純度。DNA樣品的濃度（g / l）:OD260稀釋倍數(shù)50/1000RNA樣品的濃度（g / l）：OD260稀釋倍數(shù)40/1000方案二 溴化乙錠法一、原理溴化乙錠（EB）是一種嵌入型染料，其上的一個(gè)扁平的基團(tuán)可插入到DNA或

4、RNA鏈的堆積堿基之間。溴化乙錠的嵌入基團(tuán)與堿基的接近使二者緊密結(jié)合。DNA吸收254nm的紫外輻射并傳遞能量給EB，而EB本身在302nm和366nm處有光吸收。吸收的能量在590nm處釋放，并表現(xiàn)為橙紅色熒光。結(jié)合的EB的熒光產(chǎn)率遠(yuǎn)大于游離EB的熒光產(chǎn)率。EB結(jié)合量的多少與DNA的大小和構(gòu)型有關(guān)，而熒光強(qiáng)度正比于嵌入溴化乙錠的量。對(duì)于單一構(gòu)型的同種DNA樣品來(lái)說(shuō)，溴化乙錠的嵌入量與樣品溶液的DNA含量成正比。二、材料、試劑及器具1、 標(biāo)準(zhǔn)DNA樣品:已知濃度的線型DNA，以TE稀釋為梯度濃度的一系列標(biāo)準(zhǔn)樣品。2、 質(zhì)粒DNA的酶切樣品（待測(cè)）3、 溴化乙錠（EB）5g / ml：以PH8.

5、0的TE稀釋10mg/ml母液而的。4、 紫外透射儀。三、操作步驟黑色塑料板（或其他替代物）在其上點(diǎn)上兩排溴化乙錠2l液滴，每排六點(diǎn)取標(biāo)準(zhǔn)樣品2l與第一排溴化乙錠混勻，則各點(diǎn)的DNA濃度分別為 （單位：ng/l）:20、15、10、5、2、1取待測(cè)樣品經(jīng)過(guò)梯度稀釋后，各加2l于第二排的溴化乙錠上混勻 梯度稀釋（單位：l）把以上塑料板放到紫外投射儀的樣品臺(tái)上關(guān)好樣品室門。以短波紫外光激發(fā)熒光。觀察每一點(diǎn)的熒光強(qiáng)度或拍照。比較上下兩排得亮度，確定待測(cè)樣品的濃度四、注意事項(xiàng)1、 標(biāo)準(zhǔn)樣品含單一種類的DNA，且大小與待測(cè)樣品相近。2、 待測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品使用同樣的體積.3、 EB具有中度毒性、強(qiáng)致癌性

6、，操作時(shí)切記戴手套，切勿沾染到衣物、皮膚、眼晴、口鼻等。4、 沾有EB的用具使用完畢統(tǒng)一集中于回收容器中，經(jīng)凈化處理后方可棄。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1、 繪出所觀察到的現(xiàn)象（以點(diǎn)的密度代表亮度）2、 請(qǐng)估算待測(cè)DNA原液的濃度。要求記錄測(cè)定原始數(shù)據(jù)，計(jì)算待測(cè)樣品的濃度和純度；并對(duì)你的實(shí)驗(yàn)結(jié)果作出評(píng)價(jià)，提出下一步提純工作的設(shè)想。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA采用1%的瓊脂糖進(jìn)行電泳，實(shí)驗(yàn)步驟為:a. 制膠：稱取0.2g瓊脂糖轉(zhuǎn)入三角瓶中，加入20mL 1TAE，混勻，于微波爐中加熱融化。稍冷卻后，加入1L EB溶液（10mg/mL），倒入預(yù)先插入梳子的凝膠槽（12cm12cm）內(nèi)。待膠凝固后，豎直拔出梳子；b. 上樣：在水平電泳槽中加入1TAE電泳緩沖液，將凝膠槽轉(zhuǎn)移到電泳槽（HE-120，上海天能科技有限公司）中，保證緩沖液的液面高于凝膠表面。在封口膜上將5L DNA樣品和1L 6loading buffer混合均勻，然后小心的加入到凝膠的點(diǎn)樣孔中。Marker為 DNA/Hind III，上樣量為5L。c. 跑膠：確認(rèn)樣品孔所在的一側(cè)為