HPLC在藥物分析中的應用

1、高效液相色譜及其在藥物分析中的應用摘要：高效液相色譜法的發(fā)展非常迅猛，許許多多的新方法不斷涌現，它具有分離效率高，選擇性好，分析速度快，操作自動化和應用范圍廣的特點。本文主要簡單介紹高效液相色譜的知識及其在藥物分析中的廣泛應用，通過實例描述了高效液相色譜法的優(yōu)點。 高效液相色譜(HPLC)是結合經典液相色譜及氣相色譜的分離原理。由于與氣相色譜法相比，高效液相色譜法具有下列主要優(yōu)點：不受試樣的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，應用范圍廣可選用不同性質的各種溶劑作為流動相，而且流動相對分離的選擇性有很大作用，因此分離選擇性高；一般在室溫條件下進行分離，不需要高柱溫。因而廣泛應用于生物化學，生物醫(yī)學，石油化工

2、，合成化學，環(huán)境監(jiān)測，食品衛(wèi)生，以及商檢，法檢和質檢等許多分析檢驗部門。高效液相色譜不僅僅是一種有力的分析工具，而且越益成為分離制備和純化的手段。 液相色譜在國內和國外已被廣泛地應用于藥物分析，尤其在我國，近十幾年來HPLC方法越來越受到重視。中國藥典1985年版才規(guī)定使用，該版只有8個品種規(guī)定使用HPLC方法檢測，到了1995版達到113個品種，2000版藥典的應用達到了282種，2005版僅藥典一部的應用達到了479種，涉及518項；藥典二部中采用高效液相色譜法的品種有848種，較2000年版增加了566次，其中復方制劑、雜質或輔料干擾因素多的品種多采用高效液相色譜法。2010年藥典則更多

3、的用液相色譜法取代了某些藥物含量測定的薄層法，并引入了各式各樣的檢測器。由此可見，我國高效液相色譜法在藥物分析中的重要性。 1. 高效液相色譜儀的進展 高效液相色譜(HPLC)是20世紀70年代迅速發(fā)展起來的一種分離分析技術，是目前各種色譜模式中應用最廣的一個領域。據估計，世界上幾百萬種化合物中除20宜用氣相色譜(Gc)分離分析外，其余80的化合物，包括大(高)分子化合物、離子型化合物、熱不穩(wěn)定化合物以及有生物活性的化合物都可以用不同模式的HPLC(正相HPLC、反相HPLC、離子交換色譜和離子色譜、體積排除色譜、親合色譜等)進行分離分析。因此，自80年代以來HPLC成為國際分析化學界發(fā)展最快

4、的一個分支，無論是儀器的銷售額，還是論文的發(fā)表數，均雄居同期所有分析儀器的首位，在很多學科領域內都得到了廣泛的應用。 HPLC儀器一般由輸液系統、進樣器（現有很多的都是自動進樣系統）、色譜柱、檢測器和計算機控制系統(工作站)組成（如圖1），制備型儀器還配有餾份收集系統。其中，輸液系統主要有高壓輸液泵，有的儀器還有在線脫氣和梯度洗脫裝置，如液相色譜儀安捷倫1200四元系統可以在使用不同溶劑的方法之間進行快速切換，可以使用二元、三元和四元梯度，還有島津儀器自動進樣，自動化儀器控制和數據處理。檢測器用于連續(xù)檢測色譜柱流出的物質，進行定性定量分析。要求其靈敏度高、噪音小、基線穩(wěn)定、響應值的線性范圍寬等

5、。常用的有紫外檢測器，包括光二極管陣列檢測器，可快速提供檢測物的紫外光譜，以幫助鑒別。蒸發(fā)光散射檢測器適用于檢測揮發(fā)性低于流動相的組分，主要用于檢測糖類、高級脂肪酸、磷脂、維生素、氨基酸、甘油三酯及甾體等，但是其靈敏度較低，此外，流動相必須是揮發(fā)性的，不能含有緩沖鹽等。熒光檢測器只適用于能產生熒光的物質，如生物胺、維生素和甾體化合物等。安培檢測器尤其適用于痕量組分的分析，具有氧化還原活性的物質都能檢測，如活體透析液中生物胺，酚、羰基化合物等。而液相色譜-質譜聯用技術，接口部分巳取得重要進展。由粒子束、熱噴霧，發(fā)展到最近的電噴霧接口，聯用技術日趨成熟，性能大大改進。液相色譜-質譜聯用能給出分析物

6、的質譜圖，提供分析物的結構信息，對鑒別非常有利。液相色譜一雙質變聯用增加了分離能力，并提供更多的結構信息，檢測靈敏度也大大提高。2. 高效液相色譜在藥物分析中的應用 高效液相色譜在藥物分析中的應用范圍越來越廣，高效液相色譜由于具有高選擇性、高靈敏度，并可同時用于有關物質檢查與含量測定的特點，已成為醫(yī)藥研究的有力工具。如在中草藥有效成分的分離和純度測定、人工合成藥物成分的定性和定量測定、新型高效手性藥物中手性對映體含量的測定以及藥物代謝物的測定等方面都需要用到HPLC的不同測定方法予以解決。而目前高效液相色譜的蒸發(fā)光散射檢測器的應用更體現了它在藥物分析中的重要地位。2.1天然藥物分析 天然藥物的

7、來源有動物、植物和礦物之分，其中以植物類為主。由于天然藥物的化學成分復雜，其有效成分，可能有一個，也可以有多個，這對于控制藥品質量，建立質量標準來說比較困難，HPLC可通過對天然藥物的有效成分進行分離鑒定，再測定有效成分的含量；通過指紋圖譜建立識別模式，可以判定藥材的質量高低。2.2 天然藥物及復方成藥分析 復方制劑、雜質或輔料干擾因素多的品種多采用高效液相色譜法。增免扶正片系由當歸、黨參、黃芪等十幾味天然藥物精制而成，具有益氣生津、活血養(yǎng)血、滋補肝腎、健脾開胃之功效，主要用于抗缺氧、抗疲勞、抗衰老，長期服用可扶正祛邪，提高機體免疫功能，健身強體，益壽延年。該藥對心、肝、脾、腎虛、納差、心腦血

8、管疾病、神經衰弱、慢性肝炎、脂肪肝等都有較好的防治作用。 由于化學藥品的開發(fā)費用昂貴，而且毒副作用大，近年來人們已把目光轉向自然、民族傳統醫(yī)藥、草藥、植物藥等天然藥物，據世界衛(wèi)生組織統計，當前全世界60多億人口中80的人使用過天然醫(yī)藥。在全世界藥品市場中，天然物質制成的藥品已占30，國際上植物藥市場份額已達300億美元，且每年以20 以上的速度增長。HPLC分析必定能為我國傳統中醫(yī)藥實現現代化，走向世界提供強有力的技術支持。2.3 抗生素分析如甲磺酸帕珠沙星，阿奇霉素，乳酸左氧氟沙星，氟羅沙星等品種的大容量注射液的鑒別，含量測定，相關物質的測定等都采用的是HPLC法，其避免了抗生素的高濃度下抑

9、菌性強，微生物法時間長，專一性差的特點。 2.4 手性藥物分析 在生物體內，幾乎所有具有重要生理意義的有機生物分子都有手性(chirality)，絕大多數都是旋光性物質。兩種化學組成、分子式完全相同的化合物，但因組成化合物的原子在空間取向不同，而成為鏡像的化合物，稱為手性化合物。由于對映體的物理、化學性質相同，實現它們的分離就比較困難，如大多數氨基酸都有右旋體和左旋體，但往往只能獲得右旋體和左旋體的混合物。還有乳酸左氧氟沙星，其對映體右旋屬于雜質，在HPLC中就能很好的反應出來。、圖-2乳酸左氧氟沙星及其光學異構體的色譜圖手性藥物往往呈現一種對映體具有強的生物活性和藥效，而另一種卻無效。近年來

10、，對手性藥物的拆分定量分析進行了廣泛深入的研究。其中，對生物體液中藥物對映體的分離分析，有利于了解各種對映體的藥代動力學、體內代謝過程和生物利用度。因此對手性藥物對映體的拆分也是HPLC分析的熱點。手性HPLC拆分法是以現代HPLC技術為基礎引入手性環(huán)境使對映異構體間呈現物理特征的差異而進行分離。HPLC法拆分手性藥物對映體可分為直接法和間接法。前者是將不對稱中心引入分子間，可分為手性流動相添加劑(CMP)法和手性固定相(CSP)法；后者又稱為手性試劑衍生化(CDR)法，它是將不對稱中心引入分子內。 手性試劑衍生化法是將對映體經手性試劑衍生，生成非對映異構體后，利用常規(guī)HPLC方法進行分離和測

11、定。適用于不宜直接拆分測定的化合物如手性脂肪胺類、醇類等。該法分離效果好，分離條件簡便，但對手性衍生試劑的要求較高，操作比較麻煩，多在其它方法無法實現時才采用。對生物樣品中對映體拆分過程中，由于內源性物質及代謝產物的干擾，單用HPLC分析，易造成譜峰重疊，不能直接分析體內手性藥物。目前，使用多柱偶聯技術已成功解決了該類問題。 目前，HPLC是在手性藥物拆分中應用最多的方法之一，可以預見，該方法因其具有快速、方便、精確的特點，在未來的手性藥物研究中，將得到更廣泛的應用。2.5 在鑒別中的應用 在HPLC法中,保留時間與組分的結構和性質有關,是定性的參數,可用于藥物的鑒別.如中國藥典收載的藥物頭孢

12、羥氨芐的鑒別項下規(guī)定:在含量測定項下記錄的色譜圖中,供試品主峰的保留時間應與對照品主峰的保留時間一致.頭抱拉定,頭孢噻酚鈉等頭孢類藥物以及地西泮注射液,曲安奈德注射液等多種藥物均采用HPLC法進行鑒別. 2.6 在雜質檢查中的應用 HPLC分離效能高,靈敏,在藥物的雜質檢查中應用廣泛.主要用于藥物中有關物質的檢查.“有關物質”是指藥物中存在的合成原料,中間體,副產物,降解產物等物質,這些物質的結構和性質與藥物相似,含量很低,只有采用色譜的方法才能將其分離并檢測.若雜質是已知的,又有雜質的對照品,可用雜質對照品做對照進行檢查.若雜質是未知的,可以采用主成分自身對照法或峰面積歸一化法進行檢查.如甲

13、磺酸帕珠沙星等莫西沙星等沙星類，還有氟康唑，替硝唑等產品都是用此法做鑒別。圖-3奧硝唑有關物質的色譜圖2.7在含量測定中的應用 用高效液相色譜法側定含量可以消除藥物中的雜質,制劑中的附加劑及共存的藥物對測定的干擾.中藥材及其制劑組成復雜,基中不少有效成分的含量測定也越來越多地采用了高效液相色譜法.如維生素B2，B6，替硝唑，氟康唑，氟羅沙星，氯霉素等藥品，均采用此法測含量。圖-4氯霉素滴耳液的含量測定色譜圖2.8 在體內藥物分析中的應用 HPLC由于測定迅速準確，流動相選擇范圍廣，靈敏度高(10-12 gmL以上)，填充柱種類多，且可供選擇的檢測器也多。所以是實驗室研究中一種很好的體內分析方法

14、。在國內外都很受重視大多數藥物都有紫外吸收，所以最常用的檢測器是紫外檢測器。多數藥物及內源性物質極性均較大，利用其極性差，可以采用RP-HPLC色譜柱，可獲得良好分離效果。3 .液相色譜-質譜聯用技術在藥物分析中的應用 液相色譜-質譜聯用技術(Liquid Chromatrography-Mass Spectrometry)是當代最重要的分離和鑒定方法之一。它是以HPLC為分離手段,M S為檢測器的一門綜合性分析技術,它集LC的高分離能力與MS的高靈敏度、極強的定性專屬特 異性于一體,成為藥物分析研究中不可或缺的有效工具。液相色譜-質譜聯用法(LC/MS )由于彌補了傳統LC檢測器的不足,在過

15、去的10年中有力地推動了藥物分析研究。目前,許多劑量小藥效強的藥物及其代謝產物多為極性強、難揮發(fā)的化合物,而且藥物隨著生物技術的發(fā)展,極性較強的生物活性化合物如多肽和高分子量的蛋白將占有越來越重要的地位。因此LC-MS作為一種高靈敏度和高選擇性的方法來分析上述化合物,將在藥物分析研究領域中起著重要的作用。尤其是對藥物的吸收、分布、代謝和排泄的研究,已部分提前到化合物篩 選階段進行。而LC/MS接口技術的不斷改進,與強大的結構分析、定性和定量能力相結 合,較好地適應了現代體內藥物分析研究對高精密度和準確度分析方法的需求,而獲得廣泛應用。 LC-MS在藥物分析領域的應用及其進展質譜作為液相色譜的一

16、個選擇性檢測器,大大增強了 LC的鑒定能力,因此LC-MS是分析和鑒定復雜混合物的強有力的工具,尤其適用于痕量測定的藥物分析領域,其在藥物分析領域的應用已有所報道。 液相色譜-質譜聯用技術體現了色譜和質譜優(yōu)勢的互補,將色譜的高分離性能和質譜鑒別力強的特點相結合,組成了較完善的現代分析技術。正是由于液相色譜-質譜聯用法具有高度的專屬性,對多數藥物的檢測靈敏度超過其他分析方法, 使定量測試速度顯著加快,可以對混合物中的微量組分進行結構分析,適應了現代體內藥物分析研 究中高通量和高精度的要求,無疑已經成為藥物動力學和代謝研究的核心分析技術。而且隨著現代 化高新技術的不斷發(fā)展及液相色譜-質譜聯用技術自

17、身的優(yōu)點,液相色譜-質譜聯用技術必將在未來幾年不斷發(fā)展且在藥物分析中發(fā)揮越來越重要的作用。4 .展望 中國加入WT0，這無疑給中國的醫(yī)藥行業(yè)帶來了新的機遇和挑戰(zhàn)。在本世紀初年中國要完成醫(yī)藥企業(yè)的GMP認證。許多企業(yè)由于在生產設備及檢測設備落后，而不能通過GMP認證，企業(yè)將害被無情地淘汰出所行也。液相色譜的應用大大加快中國醫(yī)藥行業(yè)同國際接軌的步伐，為我們參與競爭打下基礎。中國的醫(yī)藥要想走出國際。尤其是中藥，必須要達到歐洲、美國、日矗等發(fā)達國家的質量標準。這是制約我國中藥現代化、科學化與國際接軌需要解決的首要問題。中藥材質量的研究目前基本上停留在質量控制標準研究的階段。最近，一些先進的檢測儀器成功的用在了高效液相色譜分析法上，使得高效液相色譜的應用更廣泛，并充分利用高效快速、選擇性好、靈敏度高等優(yōu)點，建立更加系統的成分分析方法。以HPLC為主，同其它撿測手段如質譜、核磁共振、紅外光譜等技術聯用，以及與分子生物學、現代分子藥理學相結合，必將在中藥分析中發(fā)揮很大作用，也是質量規(guī)范化、國際化的重要途徑。 藥品是用于預防、治療和診斷疾病，有目的地調節(jié)人體生理功能并規(guī)定有適應征或者功能主治、用法和用量的物質。藥品是一種特殊商品，藥品質量的好壞關系到用藥的安全和有效、關系到人民的身體健康和生命安全。因此，藥品的質量控制具有特