Western-Blotting常見問題及措施

1、Western Blotting 常見問題及解決方法（參照Pierce公司講座PPT）1.比較均一的高背景原因：解決辦法抗體濃度太高優(yōu)化/降低一抗和二抗?jié)舛确忾]液不適合比較嘗試不同的封閉液封閉不完全封閉液的選擇與優(yōu)化增加封閉液中蛋白質(zhì)濃度優(yōu)化封閉時間和溫度（RT至少1小時；4過夜）封閉液中加入Tween-20；濃度0.05抗體稀釋液中加入Tween-20；濃度0.05抗體與其它蛋白質(zhì)交叉反應(yīng)更換不同的封閉液；勿在Biotin/avidin體系中使用脫脂奶粉封閉降低二抗?jié)舛葯z測二抗與膜的交叉反應(yīng)性原因：解決辦法漂洗不完全增加漂洗時間和緩沖液體積漂洗液中加入Tween-20；濃度0.05曝光時間太

2、長縮短曝光時間膜的問題使用干凈鑷子；戴手套操作換一張新膜用足夠的液體，膜始終保持濕潤孵育時使用脫色搖床避免膜重疊，互相覆蓋小心操作，勿毀損膜緩沖液污染使用新緩沖液過濾緩沖液2. 斑點(diǎn)、發(fā)泡式或閃爍式的高背景原因：解決辦法抗體濃度太高優(yōu)化/降低一抗和二抗?jié)舛榷咕奂?.2um過濾或更換新二抗封閉液不適合比較嘗試不同的封閉液封閉不完全封閉液的選擇與優(yōu)化增加封閉液中蛋白質(zhì)濃度優(yōu)化封閉時間和溫度（RT至少1小時；4過夜）封閉液中加入Tween-20；濃度0.05抗體稀釋液中加入Tween-20；濃度0.05抗體與其它蛋白質(zhì)的交叉反應(yīng)更換不同的封閉液；勿在Biotin/avidin體系中使用脫脂奶粉封閉

3、減少二抗?jié)舛葯z測二抗與膜的交叉反應(yīng)性原因：解決辦法膜沒有正確濕潤使用干凈鑷子；戴手套操作換一張新膜用足夠的液體，膜始終保持濕潤孵育時使用脫色搖床避免膜重疊，互相覆蓋小心操作，勿毀損膜緩沖液污染使用新緩沖液過濾緩沖液儀器污染保證所有儀器，用具干凈確保膜上無殘留膠3. 信號弱或者無信號原因：解決辦法轉(zhuǎn)膜不完全1.轉(zhuǎn)膜后，染膠以決定轉(zhuǎn)膜效率2.使用Memcode染膜以決定轉(zhuǎn)膜效率3.保證轉(zhuǎn)膜時膠與膜充分結(jié)合4.濾紙膜膠，電極方向正確裝配5.根據(jù)說明書，對膜進(jìn)行處理如濕潤6.電轉(zhuǎn)時防止過熱7.使用陽性對照或預(yù)染Marker8.優(yōu)化轉(zhuǎn)移時間和電流9.使用Pierce轉(zhuǎn)膜緩沖液10.保證樣品處理時，樣品不

4、被破壞（抗原決定簇）蛋白質(zhì)與膜結(jié)合不充分加20甲醇于轉(zhuǎn)膜緩沖液；低分子蛋白質(zhì)透過膜；使用小孔徑膜抗體增加抗體濃度；抗體與抗原結(jié)合差；抗體喪失活性抗原不足增加上樣量抗原被封閉液遮蔽試用不同的封閉液優(yōu)化封閉液中蛋白質(zhì)濃度縮短封閉時間緩沖液里有疊氮鈉去掉疊氮鈉曝光時間太短延長曝光時間底物孵育時間太短5分鐘膜的選擇錯誤Pico底物首先推薦使用NC，PVDF膜需要條件優(yōu)化Duro/Femto底物，推薦使用NC； PVDF；尼龍或電荷修飾的尼龍膜底物喪失活性Pico/ Duro底物室溫穩(wěn)定12個月Femto底物室溫穩(wěn)定至少6個月底物與二抗孵育發(fā)光檢測保證兩種底物成分沒有交叉污染膜被剝離過剝離會導(dǎo)致抗原丟失或變性避免重復(fù)檢測膜上蛋白質(zhì)被消化（gelatin)封閉物質(zhì)可能有蛋白質(zhì)降解活性蛋白質(zhì)在儲存過程中降解重新制備樣品4. 非特異性條帶原因：解決辦法：底物太靈敏交叉反應(yīng)抗原濃度太高抗體濃度太高降低抗體濃度SDS非特異性結(jié)合到膠上的蛋白質(zhì)1.轉(zhuǎn)膜后充分清洗2.不用SDS5. 彌散型條帶原因：解決辦法：抗體濃度太高降低抗體濃度蛋白質(zhì)上樣量太多降低蛋白質(zhì)上樣量6. 白色條帶/黑點(diǎn)/信號下降太快原因：解決辦法：抗體濃度太高1.降低抗體濃度，特別是二抗?jié)舛?. 部分區(qū)