固定化酶和固定化細(xì)胞

1、固定化酶和固定化細(xì)胞,Company Logo,固定化酶的定義,所謂固定化酶(immobilized enzyme)，是指在一定的空間范圍內(nèi)起催化作用，并能反復(fù)和連續(xù)使用的酶。,Company Logo,1916年，Nelson和Griffin發(fā)現(xiàn)酶的固定化現(xiàn)象； 1969年，千畑一郎等將固定化氨基?；笐?yīng)用于生產(chǎn)L-氨基酸，開(kāi)創(chuàng)了固定化酶應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的先例； 1971年召開(kāi)的第一屆國(guó)際酶工程會(huì)議上，建議采用統(tǒng)一的英文名稱Immobilized Enzyme； 1973年，固定化大腸桿菌菌體中的天冬氨酸酶連續(xù)生產(chǎn)L-天冬氨酸。 1986年，利用固定化原生質(zhì)體發(fā)酵生產(chǎn)堿性磷酸酶和葡萄糖氧化酶等

2、相繼獲得成功。,酶固定化技術(shù)發(fā)展史,Company Logo,從目前的發(fā)展?fàn)顩r來(lái)看，盡管酶種類繁多，但已經(jīng)固定化的酶卻相對(duì)有限，采用固定化酶技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)的企業(yè)尚屬少數(shù)，真正在工業(yè)上使用的固定化酶還僅限于葡萄糖異構(gòu)酶、葡萄糖氧化酶和青霉素酰化酶等為數(shù)不多的十幾個(gè)酶種，故仍需大力研究開(kāi)發(fā)使更多的固定化酶和細(xì)胞能適用于工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)。,發(fā)展現(xiàn)狀,Company Logo,固定化酶的優(yōu)點(diǎn),同一批固定化酶能在工藝流程中重復(fù)多次地使用； 固定化后，和反應(yīng)物分開(kāi)，有利于控制生產(chǎn)過(guò)程，同時(shí)也省去了熱處理使酶失活的步驟； 穩(wěn)定性顯著提高； 可長(zhǎng)期使用，并可預(yù)測(cè)衰變的速度； 提供了研究酶動(dòng)力學(xué)的良好模型。,Com

3、pany Logo,固定化酶的制備原則,（1）必須注意維持酶的構(gòu)象，特別是活性中心的構(gòu)象。 （2）酶與載體必須有一定的結(jié)合程度。酶的固定化既不影響酶的原有構(gòu)象，又能使固定化酶能有效回收貯藏，利于反復(fù)使用。 （3）固定化應(yīng)有利于自動(dòng)化、機(jī)械化操作。這要求用于固定化的載體必須有一定的機(jī)械強(qiáng)度，才能使之在制備過(guò)程中不易破壞或受損。,Company Logo,（4）固定化酶應(yīng)有最小的空間位阻。 （5）固定化酶應(yīng)有最大的穩(wěn)定性。在應(yīng)用過(guò)程中，所選載體應(yīng)不和底物、產(chǎn)物或反應(yīng)液發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。 （6）固定化酶的成本適中。,Company Logo,固定化酶（細(xì)胞）的制備方法,酶和細(xì)胞固定化方法 載體結(jié)合法 交

4、聯(lián)法 包埋法 網(wǎng)格型 微囊型 物理吸附法 離子結(jié)合法 共價(jià)結(jié)合法 熱處理（細(xì)胞）,Company Logo,Company Logo,1、吸附法,通過(guò)載體表面和酶分子表面間的次級(jí)鍵相互作用而達(dá)到固定目的的方法，是固定化中最簡(jiǎn)單的方法。 吸附法又可分為物理吸附法和離子吸附法。,Company Logo,物理吸附法(physical adsorption)是通過(guò)非特異性物理吸附作用將酶直接吸附在水不溶性載體表面上而使酶固定化的方法。包括范德華力、疏水相互作用、氫鍵。 物理吸附法常用的載體： 有機(jī)載體：纖維素、膠原、淀粉及面筋等； 無(wú)機(jī)載體：活性炭、氧化鋁、皂土、多孔玻璃、硅膠、二氧化鈦、羥基磷灰石

5、等。,物理吸附法,Company Logo,離子吸附法(ion adsorption)是通過(guò)離子鍵使酶與含有離子交換基團(tuán)的水不溶性載體相結(jié)合的固定化方法。 此法固定的酶有葡萄糖異構(gòu)酶、糖化酶、-淀粉酶、纖維素酶等，在工業(yè)上用途較廣。,離子吸附法,Company Logo,離子吸附法常用的載體： 陰離子交換劑：DEAE-纖維素、四乙氨基乙基(TEAE)-纖維素等； 陽(yáng)離子交換劑有羧甲基(CM)-纖維素、纖維素檸檬酸鹽、Dowex-50等。 其吸附容量一般大于物理吸附劑。離子吸附法具有操作簡(jiǎn)便、條件溫和、酶活力不易喪失等優(yōu)點(diǎn)。此外，吸附過(guò)程同時(shí)可以純化酶。,Company Logo,2、包埋法,包

6、埋法（entrapment）是將酶包埋在高聚物的細(xì)微凝膠網(wǎng)格中或高分子半透膜內(nèi)的固定化方法。前者又稱為凝膠包埋法，酶被包埋成網(wǎng)格型；后者又稱為微膠囊包埋法，酶被包埋成微膠囊型。,Company Logo,（1）凝膠包埋法 將聚合物的單體與酶溶液混合，再借助于聚合促進(jìn)劑(包括交聯(lián)劑)的作用進(jìn)行聚合，酶被包埋在聚合物中以達(dá)到固定化。 凝膠包埋法常用的載體有海藻酸鈉凝膠、角叉菜膠、明膠、瓊脂凝膠、卡拉膠等天然凝膠以及聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光交聯(lián)樹(shù)脂等合成凝膠或樹(shù)脂。,Company Logo,（2）微膠囊包埋法 微膠囊包埋即將酶包埋在各種高聚物制成的半透膜微膠囊內(nèi)的方法。它使酶存在于類似細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境

7、中，可以防止酶的脫落，防止微囊外的環(huán)境直接接觸，從而增加了酶的穩(wěn)定性。常用于制造微膠囊的材料有聚酰胺、火棉膠、醋酸纖維素等。,Company Logo,3、共價(jià)鍵結(jié)合法,共價(jià)鍵結(jié)合法(covalent binding）是將酶與聚合物載體以共價(jià)鍵結(jié)合的固定化方法。,Company Logo,（1）酶蛋白N末端的-氨基或賴氨酸殘基的-氨基。 （2）酶蛋白C末端的-羧基、天門(mén)冬氨酸殘基的-羧基以及谷氨酸殘基的-羧基。 （3）苯丙氨酸和酪氨酸殘基的苯環(huán)。 （4）其他：半胱氨酸殘基的巰基；絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基的羥基；組氨酸殘基的咪唑基；色氨酸殘基的吲哚基。,酶蛋白上可供載體結(jié)合的功能基團(tuán),酶共價(jià)偶

8、聯(lián)的載體的功能基團(tuán)：芳香氨基、羥基、羧基和羧甲基等。,Company Logo,載體活化的主要反應(yīng),重氮法 疊氮法 溴化氰法 芳香烴化法,Company Logo,（1）重氮法 重氮法是將酶蛋白與水不溶性載體的重氮基團(tuán)通過(guò)共價(jià)鍵相連接而固定化的方法，是共價(jià)鍵法中使用最多的一種。 常用的載體有多糖類的芳族氨基衍生物、氨基酸的共聚體和聚丙烯酰胺衍生物等。,Company Logo,（2）疊氮法 即載體活化生成疊氮化合物，再與酶分子上的相應(yīng)基團(tuán)偶聯(lián)成固定化酶。 含有羥基、羧基、羧甲基等基團(tuán)的載體都可用此法活化。如CMC、CM-sephadex（交聯(lián)葡聚糖）、聚天冬氨酸、乙烯-順丁烯二酸酐共聚物等都可

9、用此法來(lái)固定化酶。其中使用最多的是羧甲基纖維素疊氮法。,Company Logo,（3）溴化氰法 即用溴化氰將含有羥基的載體，如纖維素、葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠等，活化生成亞氨基碳酸酯衍生物，然后再與酶分子上的氨基偶聯(lián)，制成固定化酶。 任何具有連位羥基的高聚物都可用溴化氰法來(lái)活化。,Company Logo,（4）烷基化和芳基化法 以鹵素為功能團(tuán)的載體可與酶蛋白分子上的氨基、巰基、酚基等發(fā)生烷基化或芳基化反應(yīng)而使酶固定化。 此法常用的載體有鹵乙酰、三嗪基或鹵異丁烯基的衍生物。,Company Logo,優(yōu)點(diǎn)：共價(jià)鍵的鍵能高，酶和載體之間的結(jié)合相當(dāng)牢固，即使用高濃度底物溶液或鹽溶液，也不會(huì)使酶分子

10、從載體上脫落下來(lái)，具有酶穩(wěn)定性好、可連續(xù)使用較長(zhǎng)時(shí)間的優(yōu)點(diǎn)。 缺點(diǎn)：載體活化的難度較大，操作復(fù)雜，反應(yīng)條件較劇烈，制備過(guò)程中酶直接參與化學(xué)反應(yīng)，易引起酶蛋白空間構(gòu)象變化。,Company Logo,4、交聯(lián)法,交聯(lián)法（cross-linking）是使用雙功能或多功能試劑使酶分子之間相互交聯(lián)呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化方法。 常用的雙功能試劑有戊二醛、己二胺、異氰酸衍生物等。 戊二醛和酶蛋白中的游離氨基發(fā)生Schiff反應(yīng)，形成薛夫堿，從而使酶分子之間相互交聯(lián)形成固定化酶。,Company Logo,Company Logo,5、選擇性熱變性法,專用于細(xì)胞固定化。是將細(xì)胞在適當(dāng)?shù)臏囟认绿幚硎辜?xì)胞膜蛋白變性

11、，但不使酶變性而使酶固定于細(xì)胞內(nèi)的方法。,Company Logo,6、固定化活細(xì)胞,將活細(xì)胞限制或定位于特定空間位置的方法。,Company Logo,無(wú)需進(jìn)行酶的分離和純化，減少酶的活力損失，同時(shí)大大降低了成本； 保持了酶的原始狀態(tài)，比固定化酶的穩(wěn)定性更高，對(duì)污染的抵抗力更強(qiáng)； 細(xì)胞本身含多酶系統(tǒng)，可催化一系列反應(yīng)，且不需添加輔助因子； 細(xì)胞生長(zhǎng)停滯時(shí)間短，細(xì)胞多，反應(yīng)快等。,固定化活細(xì)胞的優(yōu)越性,Company Logo,缺點(diǎn) 必須保持菌體的完整，需防止菌體的自溶，否則影響產(chǎn)物的純度； 必須抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白酶對(duì)目的酶的分解； 胞內(nèi)多酶的存在，會(huì)形成副產(chǎn)物； 載體、細(xì)胞膜或細(xì)胞壁會(huì)造成底物滲

12、透與擴(kuò)散的障礙等。,Company Logo,制備方法,固定化活細(xì)胞的制備條件比固定化酶更要溫和，其制備方法主要有物理吸附法和包埋法兩種。,固定化酶的特性,Company Logo,固定化酶的形狀,固定化酶的形式多樣，依不同用途有顆粒狀、纖維狀、酶膜和酶管等形狀。 其中顆粒占絕大多數(shù)，它和纖維狀主要用于工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)，如裝成酶柱用于連續(xù)生產(chǎn)，或在反應(yīng)器中進(jìn)行批式攪拌反應(yīng)。,Company Logo,固定化酶的性質(zhì),酶活力 酶穩(wěn)定性 酶學(xué)特性,Company Logo,固定化酶的酶活力,固定化酶的活力在多數(shù)情況下比天然酶的活力低，其原因可能是： 酶活性中心的重要氨基酸殘基被載體結(jié)合； 高級(jí)結(jié)構(gòu)和空

13、間構(gòu)象的改變； 空間位阻的影響； 內(nèi)擴(kuò)散阻力； 半透膜的隔離。 個(gè)別情況下，酶經(jīng)固定化后其活力升高。,Company Logo,固定化酶的穩(wěn)定性,操作穩(wěn)定性：體內(nèi)半衰期 貯藏穩(wěn)定性：低溫放置 熱穩(wěn)定性：耐熱性提高 對(duì)蛋白酶的穩(wěn)定性：空間位阻 其他：對(duì)有機(jī)溶劑、pH、酶抑制劑等的穩(wěn)定性均有提高。,Company Logo,固定化酶的酶學(xué)特性,底物特異性：對(duì)高分子底物的活性明顯下降； 最適pH：最適pH和pH曲線常會(huì)發(fā)生偏移； 最適溫度：多數(shù)較游離酶高； 動(dòng)力學(xué)常數(shù)：Km均增大，增大幅度視情況而定； 最大反應(yīng)速度：與游離酶大多數(shù)是相同或相近。,酶反應(yīng)器及其類型,Company Logo,酶反應(yīng)器的

14、定義,以酶為催化劑進(jìn)行反應(yīng)所需要的設(shè)備稱之為酶催化反應(yīng)器，簡(jiǎn)稱酶反應(yīng)器。,Company Logo,酶反應(yīng)器的類型,間歇式攪拌罐反應(yīng)器，BSTR 連續(xù)流動(dòng)攪拌罐反應(yīng)器，CSTR 填充床反應(yīng)器，PBR 流化床反應(yīng)器，F(xiàn)BR 連續(xù)攪拌罐-超濾膜反應(yīng)器，CSTR/UFR 循環(huán)式反應(yīng)器，RCR,反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),Company Logo,這類反應(yīng)器結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，造價(jià)較低，傳質(zhì)阻力很小，反應(yīng)能迅速達(dá)到穩(wěn)態(tài)，主要應(yīng)用在飲料和食品工業(yè)中。其缺點(diǎn)是操作麻煩，在反復(fù)回收過(guò)程中固定化酶容易損失，所以工業(yè)規(guī)模的固定化酶很少采用。常用于游離酶。,BSTR,間歇式攪拌罐反應(yīng)器， BSTR,Company Logo,這種反應(yīng)

15、器在運(yùn)轉(zhuǎn)過(guò)程中，底物以恒定的流速流入反應(yīng)器，與此同時(shí)，反應(yīng)液則以同樣的流速流出反應(yīng)器。反應(yīng)桶內(nèi)裝有攪拌器，使反應(yīng)組分與固定化酶顆?；旌暇唬隹谔幱羞^(guò)濾膜，可使不斷補(bǔ)充新鮮底物與反應(yīng)液流量維持動(dòng)態(tài)平衡。,連續(xù)流動(dòng)攪拌罐反應(yīng)器，CSTR,CSTR,Company Logo,優(yōu)點(diǎn)：反應(yīng)液混合良好，各部位的成分相同，并與流出液的組成也一致。CSTR的開(kāi)放結(jié)構(gòu)使得調(diào)換固定化酶比較容易，而且有利于控制溫度和調(diào)節(jié)pH，還能夠處理膠態(tài)或不溶性底物，受底物抑制的固定化酶采用CSTR有較高的轉(zhuǎn)化率。 缺點(diǎn)：由攪拌產(chǎn)生的剪切力較大，易打碎磨損固定化酶顆粒。需改良的CSTR。,Company Logo,填充床反應(yīng)器

16、，PBR,PBR,又稱固定床反應(yīng)器?？商畛涠嘞虍愋园胪感灾锌绽w維制成管狀，內(nèi)部填充酶膜、酶片等。 在填充床反應(yīng)器內(nèi)，底物在一定方向上以恒定的速度通過(guò)固定化酶柱，以近似活塞式流動(dòng)反應(yīng)器（Plug Flow Reactor，PFR）運(yùn)轉(zhuǎn)。,Company Logo,流化床反應(yīng)器，F(xiàn)BR,FBR,FBR種裝有較小顆粒的垂直塔式反應(yīng)器。反應(yīng)時(shí)，底物溶液以足夠大的流速，從反應(yīng)器底部向上通過(guò)固定化酶柱床，便能使固定化酶顆粒始終處于流化狀態(tài)。其混合程度介于CSTR的全混型和PFR的平推流型之間。由于反應(yīng)器內(nèi)混合程度高，因此，傳熱、傳質(zhì)情況良好，可處理粘性大、含有固體顆粒的底物。,Company Logo,連

17、續(xù)攪拌罐-超濾膜反應(yīng)器，CSTR/UFR,CSTR/UFR,CSTRUF結(jié)構(gòu)是CSTR與超濾裝置聯(lián)用的酶膜反應(yīng)器。在CSTR出口處設(shè)置一個(gè)超濾裝置，通過(guò)超濾裝置，酶可以循環(huán)使用。該超濾器中的半透性超濾膜只允許小分子產(chǎn)物通過(guò)，不允許大分子酶和底物通過(guò)。 該反應(yīng)器適用于顆粒較細(xì)的固定化酶、游離酶和細(xì)胞以及小分子產(chǎn)物與大分子底物。,Company Logo,循環(huán)式反應(yīng)器，RCR,外循環(huán)反應(yīng)器,內(nèi)循環(huán)反應(yīng)器,循環(huán)操作仍能為底物與酶提供足夠的接觸機(jī)會(huì)，以達(dá)到所需的轉(zhuǎn)化率。這種反應(yīng)器可用于難溶或者不溶性底物的轉(zhuǎn)化反應(yīng)。,Company Logo,酶反應(yīng)器的選擇依據(jù),根據(jù)固定化酶的形狀： 溶液酶：BSTR

18、顆粒狀和片狀：CSTR、PBR 膜狀和纖維狀：PBR 容易變形、易粘結(jié)、顆粒細(xì)?。篎BR 根據(jù)底物的物理性質(zhì) 溶解性和濁液性底物：任何類型 顆粒狀和膠狀底物：CSTR、FBR、RCR,Company Logo,根據(jù)酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特性 產(chǎn)物對(duì)酶活性抑制：PBR 底物對(duì)酶活性抑制：CSTR 根據(jù)外界環(huán)境對(duì)酶的穩(wěn)定性的影響 改良的CSTR 根據(jù)操作要求及反應(yīng)器費(fèi)用 CSTR,固定化細(xì)胞法生產(chǎn)6-氨基青霉烷酸,Company Logo,基本原理,青霉素G經(jīng)青霉素酰化酶作用，水解除去側(cè)鏈后的產(chǎn)物稱為6-氨基青霉烷酸，也稱無(wú)側(cè)鏈青霉素。,6-APA結(jié)構(gòu)式,Company Logo,工藝路線,大腸桿菌的培養(yǎng),大腸桿菌固定化,固定化大腸桿菌反應(yīng)堆制備,轉(zhuǎn)化反應(yīng),6-氨基青霉烷酸的提取,Company Logo,工藝要點(diǎn),大腸桿菌的培養(yǎng) 菌種：大腸桿菌D816 斜面培養(yǎng)基：普通肉湯瓊脂培養(yǎng)基 發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨、氯化鈉、苯乙酸、自來(lái)水 發(fā)酵條件：通氣攪拌培養(yǎng)， 28，pH7.0,Company Logo,大腸桿菌固定化 取濕菌體 100 kg，置于40反應(yīng)罐中，在攪拌下加入50L10%戊二醛5 升，在轉(zhuǎn)移至搪瓷盤(pán)中，使之成為3-5 cm厚的液層，室溫放置2 小時(shí)，再轉(zhuǎn)移至4 冷