ELISA基礎(chǔ)知識(shí)與注意事項(xiàng).ppt

1、2020/10/12,ELISA基礎(chǔ)知識(shí)與注意事項(xiàng),2020/10/12,類容,ELISA的基本原理與相關(guān)概念 特別說(shuō)說(shuō)捕獲法 ELISA結(jié)果的影響因素 ELISA結(jié)果的處理,2020/10/12,ELISA的基本原理與相關(guān)概念,將抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或 抗體后，這種酶標(biāo)抗原或抗體既能保留與相應(yīng)抗體或抗原結(jié)合的免疫活性，又同時(shí)保留酶的活性。 由于酶具有很高的催化效率，因此可放大抗原抗體反應(yīng)效果，從而使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感性。,2020/10/12,ELISA的基本原理,抗原或抗體在體外結(jié)合到某種固相載體表面后，仍然能保持其免疫學(xué)活性而能相互特異性結(jié)合。,2020/10/12,抗原

2、抗體復(fù)合物與酶標(biāo)的二抗結(jié)合，加入合適的底物在酶的作用下顯色，顏色的深淺與特異性抗體水平成比例關(guān)系，可進(jìn)行定性與定量分析。,2020/10/12,ELISA的分類,測(cè)抗原：競(jìng)爭(zhēng)法（也可用于測(cè)抗體）、雙抗體夾心法。 測(cè)抗體：間接法、捕獲法、雙抗原夾心法,2020/10/12,競(jìng)爭(zhēng)法elisa,競(jìng)爭(zhēng)法ELISA原理標(biāo)本中的抗原與一定量的酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合，標(biāo)本中的抗原含量越多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原越少，顯色越淺。 要用于小分子抗原或半抗原的定量測(cè)定，也可對(duì)抗體進(jìn)行測(cè)定。,2020/10/12,2020/10/12,雙抗體夾心法,雙抗體夾心法ELISA 將特異性抗體包被于固相載體表面，與標(biāo)本

3、中相應(yīng)抗原相結(jié)合，洗滌后再加入酶標(biāo)的第二特異性抗體與抗原結(jié)合，加入底物后顯色。 檢測(cè)測(cè)抗原要有至少具有2個(gè)抗原決定簇,2020/10/12,包被特異性抗體,2020/10/12,雙抗原夾心法,雙抗原夾心法ELISA檢測(cè)標(biāo)本中的總抗體（包括IgM與IgG型抗體） 。將特異性抗原包被于固相載體表面，與標(biāo)本中特異性IgM與IgG型抗體結(jié)合，洗滌后加入酶標(biāo)的特異性抗原與相應(yīng)的抗體結(jié)合，洗滌后加入底物顯色,2020/10/12,2020/10/12,間接法,間接法 ELISA（Indirect ELISA）將特異性抗原包被于固相載體表面，與標(biāo)本中相應(yīng)特異性抗體結(jié)合，洗滌后再加入酶標(biāo)的抗人IgG或IgM抗

4、體與之結(jié)合，洗滌后加入底物顯色。 酶標(biāo)二抗是針對(duì)一類免疫球蛋白分子 只需要變換包被抗原，就可用一種酶標(biāo)二抗檢測(cè)各種與抗原結(jié)合的抗體,2020/10/12,2020/10/12,捕獲法,ELISA（Capture ELISA）專門(mén)用來(lái)檢測(cè)IgM型抗體的方法。將抗人IgM抗體包被于固相載體表面，與標(biāo)本中所有人IgM抗體結(jié)合，洗滌后加入特異性抗原與相應(yīng)的特異性IgM抗體結(jié)合，洗滌后再加入酶標(biāo)的抗原特異性抗體與之結(jié)合，洗滌后加入底物顯色。,2020/10/12,2020/10/12,區(qū)別理解,檢測(cè)抗原？抗體？ 包被什么？ 標(biāo)記什么？,2020/10/12,間接法與捕獲法比較,間接法：假陰性，假陽(yáng)性 捕

5、獲法：酶標(biāo)抗體的要求較高,2020/10/12,間接法的假陽(yáng)性,2020/10/12,間接法的假陰性,麻疹I(lǐng)gG,麻疹 抗原,麻疹I(lǐng)gM,酶標(biāo)抗人 IgM抗體,陽(yáng)性結(jié)果,假陰性結(jié)果,2020/10/12,ELISA的有關(guān)名詞概念,質(zhì)控血清：質(zhì)控血清是為了對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行控制而配制的血清。質(zhì)控血清可以是定值也可以是不定值，可以購(gòu)置也可以自配。自己配制時(shí)要注意選用無(wú)脂血的血清或血漿，不能用試劑盒內(nèi)的陽(yáng)性對(duì)照。若用稀釋的血清作為質(zhì)控血清，應(yīng)考慮稀釋基質(zhì)成分對(duì)結(jié)果的影響。因質(zhì)控血清與臨床標(biāo)本不一致，應(yīng)該注意對(duì)結(jié)果的分析，應(yīng)該注意質(zhì)控血清只能用于質(zhì)控活動(dòng)，不可用于標(biāo)定儀器或評(píng)價(jià)方法。用于室內(nèi)質(zhì)控的質(zhì)控血清

6、一般選取CUTOFF值2-3倍的質(zhì)控品。,2020/10/12,室內(nèi)質(zhì)控：實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部使用控制實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性的一種質(zhì)量控制。 室間質(zhì)評(píng)：用于考核各個(gè)實(shí)驗(yàn)室結(jié)果可靠性的一種考核，可分為國(guó)家級(jí)與地方級(jí)的室間質(zhì)評(píng)。可以理解為 “各個(gè)實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量評(píng)比”。,2020/10/12,臨界值（CUTOFF值）：臨界值是判斷陰陽(yáng)性或有臨床意義水平的數(shù)值，臨界值的確定是測(cè)定大量數(shù)據(jù)后應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法確定的。許多試劑都會(huì)給出臨界值或臨界值的計(jì)算方法。 本底：就是底色。如ELISA HBsAg，陽(yáng)性顯色，陰性不顯色，本底就是整個(gè)陰性顯色的情況。ELISA 抗HBcAb，陽(yáng)性不顯色，陰性顯色，本底就是整個(gè)陽(yáng)性顯色的情況。,

7、2020/10/12,靈敏度：能檢測(cè)到的分析物的最小量，表示檢測(cè)下限的能力。 相對(duì)靈敏度=真陽(yáng)性/（真陽(yáng)性+假陰性）100% 測(cè)定方法及表示方法：靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控血清、陽(yáng)性標(biāo)本稀釋終點(diǎn)、血清盤(pán)（pannel）及臨床標(biāo)本陽(yáng)性率。,2020/10/12,特異性： 真陰性標(biāo)本的檢出能力。 相對(duì)特異性=真陰性/（真陰性+假陽(yáng)性）100% 測(cè)定及表示方法：質(zhì)控血清、血清盤(pán)、臨床標(biāo)本陰性率。,2020/10/12,Elisa結(jié)果的影響因素,試劑盒的選擇 標(biāo)本 加樣與稀釋 溫育 洗版 顯色 質(zhì)控,2020/10/12,試劑盒的選擇,同行的試劑使用情況 上級(jí)部門(mén)對(duì)試劑實(shí)際使用的綜合評(píng)價(jià) 使用臨界值質(zhì)控血清進(jìn)

8、行實(shí)際檢測(cè)比較,選擇林敏度與準(zhǔn)確度高、特異性強(qiáng)試劑盒,2020/10/12,標(biāo)本,應(yīng)注意避免溶血 在5 天內(nèi)測(cè)定的血清標(biāo)本可放置于4、超過(guò)一周測(cè)定的需20保存 盡量避免反復(fù)凍融（少量分裝）,2020/10/12,加樣與稀釋,加樣本的準(zhǔn)確性（個(gè)人因素與實(shí)驗(yàn)條件） 盡可能排除主關(guān)因素（盡可能用加樣槍，避免直接使用滴瓶） 各種試劑盒標(biāo)本的稀釋使用，嚴(yán)格按照說(shuō)明是操作,2020/10/12,溫育,溫度 水浴箱 發(fā)硬板應(yīng)漂浮于水上或水面應(yīng)高于反應(yīng)板,2020/10/12,洗版,手洗 洗板機(jī) （微孔液體殘留45s）,2020/10/12,顯色,通常是A、B兩種液體，不穩(wěn)定，又顏色應(yīng)立即丟棄 先加A后加B，顯色時(shí)間嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行 終止后15內(nèi)比色,2020/10/12,質(zhì)控,室內(nèi)質(zhì)控血清 即刻法,2020/10/12,ELISA試劑的常見(jiàn)問(wèn)題原因及其解決,顯色淺，靈敏度低 假陽(yáng)性多，本底高甚至花板 重復(fù)性不好 白板,2020/10/12,顯色淺 靈敏度低,2020/10/12,2020/10/12,假陽(yáng)性多，本底高甚至花板,2020/10/12,2020/10/12,重復(fù)性不好,2020/10/12,白板,2020/10/12,結(jié)果處理,OD值出現(xiàn)負(fù)值 陰性對(duì)照