乙型肝炎病毒標(biāo)志物的檢測(cè).ppt

1、實(shí)驗(yàn)十二,乙型肝炎病毒標(biāo)志物的檢測(cè),實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?1、熟悉ELISA（ enzyme-linked immunosorbent assay ）的原理及操作方法 2、掌握乙型病毒標(biāo)志物的臨床意義,使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。 使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí)，把受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開(kāi)，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶

2、催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性或定量分析。,（一）基本原理,（一）基本原理,用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開(kāi)，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性或定量分析。,（二）實(shí)驗(yàn)試劑,ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。在這種測(cè)定方法中有3種必要的試劑： 固相的抗原或抗體， 酶標(biāo)記的抗原或抗體， 酶作用的底物。 根據(jù)試劑的來(lái)源和標(biāo)本的性狀以及檢測(cè)的具備條件，可設(shè)計(jì)出各種不同類型

3、的檢測(cè)方法。,1、雙抗體夾心法,雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原最常用的方法，操作步驟如下： （1）將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。 （2）加受檢標(biāo)本：使之與固相抗體接觸反應(yīng)一段時(shí)間，讓標(biāo)本中的抗原與固相載體上的抗體結(jié)合，形成固相抗原復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。,（三）實(shí)驗(yàn)方法,（3）加酶標(biāo)抗體：使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量正相關(guān)。 （4）加底物：夾心式復(fù)合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量。,1、把抗體固定在固相支持物上（96孔板）； 2、加

4、入蛋白質(zhì)樣品保溫，再洗去未結(jié)合的雜蛋白； 3、加入第二抗體，第二抗體結(jié)合一個(gè)供檢測(cè)用的酶（辣根過(guò)氧化物酶） 4、洗去未結(jié)合第二抗原，酶活測(cè)定。,雙抗體夾心法測(cè)抗原,2、間接法測(cè)抗體,間接法是檢測(cè)抗體最常用的方法，其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測(cè)已與固相結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。操作步驟如下： （1）將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原：洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。 （2）加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體與抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體。其他免疫球蛋白及血清中的雜質(zhì)由于不能與固相抗原結(jié)合，在洗滌過(guò)程中被洗去。,（3）加酶標(biāo)抗抗體：與固相復(fù)合物中的抗

5、體結(jié)合，從而使該抗體間接地標(biāo)記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。例如欲測(cè)人對(duì)某種疾病的抗體，可用酶標(biāo)羊抗人IgG抗體。 （4）加底物顯色：顏色深度代表標(biāo)本中受檢抗體的量。 本法只要更換不同的固相抗原，可以用一種酶標(biāo)抗抗體檢測(cè)各種與抗原相應(yīng)的抗體。,間接法測(cè)抗體,步驟一,將抗原HBsAg吸附于載體表面（廠家已經(jīng)完成）,步驟二,原理：將待測(cè)血清加入，溫育，血清中如有HBsAb，則抗原抗體結(jié)合 操作： 陽(yáng)性血清，陰性血清，待檢血清各加1孔，每孔50ul(1滴),步驟三,原理：加入酶復(fù)合物， (HBsAg-HRP),酶復(fù)合物與表面抗體結(jié)合 操作： 加酶復(fù)合物1滴,混勻, 置37溫育3

6、0分鐘 倒出液體,洗滌5次，拍干。,步驟四,加入酶的底物，酶與底物反應(yīng)，顯色 操作： 每孔加顯色液A液,B液，各1滴，37溫育15分鐘，使充分顯色。,終止反應(yīng)：每孔加終止液50l（一滴） 肉眼觀察或上機(jī)比色,步驟五,1、乙肝病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu),（四）應(yīng)用乙肝病毒標(biāo)志物的檢測(cè),大球形顆粒 （ Dane顆粒，有感染性的完整顆粒）,HBsAg （外衣殼蛋白）,HBcAg （內(nèi)衣殼蛋白）,HBV DNA,DNAP,小球形顆粒,過(guò)剩的衣殼 （ HBsAg）,管形顆粒,2、HBV的抗原組成,表面抗原HBsAg：外衣殼 核心抗原HBcAg：內(nèi)衣殼，僅感染的肝細(xì)胞核內(nèi) e抗原HBeAg：自肝細(xì)胞分泌而存在于血清中

7、,（1）表面抗原（HBsAg）與表面抗體（抗-HBs）,存在于三型顆粒中 是HBV感染的主要標(biāo)志，見(jiàn)于急性、慢性、攜帶者 抗-HBs，保護(hù)性抗體（中和抗體），標(biāo)志著機(jī)體對(duì)HBV有免疫力，見(jiàn)于恢復(fù)期、既往感染者或接種疫苗后,3、HBV的抗原抗體系統(tǒng),（2）核心抗原（HBcAg）與核心抗體（抗HBc）,內(nèi)衣殼，僅存在于感染的肝細(xì)胞核內(nèi)，不易在血液中檢出 抗原性強(qiáng)，刺激機(jī)體先產(chǎn)生IgM，后產(chǎn)生IgG，后者可在血清中存在多年 抗HBc無(wú)中和作用，高效價(jià)抗HBc IgM提示病毒在體內(nèi)復(fù)制增殖。,（3）e抗原（HBeAg）與e抗體（抗-HBe）,可溶性蛋白，游離存在于血液中 它的消長(zhǎng)與DNA聚合酶及Dane顆粒出現(xiàn)的時(shí)間一致，為病毒復(fù)制和血清有強(qiáng)傳染性的標(biāo)志。 抗-HBe有一定保護(hù)作用，是傳染性低、預(yù)后好的征象。,HBsAg: 感染的主要標(biāo)志 抗-HBs：對(duì)HBV有免疫力 HBc