乙肝丙肝核酸檢測的新平臺(臨床)【業(yè)界特制】

1、乙肝丙肝核酸檢測的新平臺 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan 全自動熒光定量分子診斷系統(tǒng),顧 劍 羅氏分子診斷,1,行業(yè)傾力,自動化程度,1992 1996 1998 2001 2003 2006,MWP,COBAS AMPLICOR,COBAS AMPLIPREP,COBAS AMPLICOR MONITOR,羅氏分子診斷,標(biāo)準(zhǔn)化 自動化 重復(fù)性,COBAS TAQMAN 48,COBAS TAQMAN 96,一直以來，羅氏分子診斷對臨床核酸檢測市場提供完善可靠和創(chuàng)新性的產(chǎn)品及解決方案,2,行業(yè)傾力,目前乙肝和丙肝臨床治療過程中遇到的主要問題,治療終點無法準(zhǔn)確判定 有些

2、病人經(jīng)一段時間治療后DNA/RNA檢測結(jié)果忽陰忽陽，但臨床癥狀依然明顯 不能及時預(yù)測耐藥（病毒學(xué)突破） 核苷（酸）類似物治療后病毒DNA/RNA快速下降至檢測限以下，不久卻發(fā)現(xiàn)病毒出現(xiàn)反跳 療效的準(zhǔn)確監(jiān)測？ 治療后12或24周病毒DNA/RNA下降幅度直接決定預(yù)后,問題的根源在哪里？,3,行業(yè)傾力,內(nèi) 容,HBV核酸檢測的現(xiàn)狀與需要 HCV核酸檢測的現(xiàn)狀與需要 羅氏的CAP/CTM能帶來什么益處 總結(jié),4,行業(yè)傾力,HBV DNA監(jiān)測在抗病毒治療中的臨床應(yīng)用,HBV DNA是監(jiān)測抗病毒治療響應(yīng)和時間的關(guān)鍵標(biāo)志物 HBV 治療的路線圖理念，為HBV DNA監(jiān)測用于臨床實踐提供了指導(dǎo) 對用藥耐藥性

3、的監(jiān)測（拉米夫定YMDD，） 肝移植HBV復(fù)發(fā)風(fēng)險的降低（術(shù)前，術(shù)后） ,5,行業(yè)傾力,HBV DNA監(jiān)測的臨床應(yīng)用 HBV治療路線圖,Keeffe E. Clin Gastro Hepatology 2007;5:890-897. 侯金林等，慢性乙型肝炎抗病毒治療方案優(yōu)化，中國肝臟病雜志,6,行業(yè)傾力,國產(chǎn)試劑現(xiàn)狀,目前使用的國產(chǎn)試劑能解決的問題，不能解決的問題： HBV試劑盒說明：5005107 IU/mL 較可信的測試范圍：1045107 IU/mL 對部分發(fā)生HBV病毒突變的病人無法準(zhǔn)確檢測 注：1 IU/mL= 1 copy/mL,7,行業(yè)傾力,內(nèi) 容,HBV核酸檢測的現(xiàn)狀與需要 H

4、CV核酸檢測的現(xiàn)狀與需要 羅氏的CAP/CTM能帶來什么益處 總結(jié),8,行業(yè)傾力,HCV DNA監(jiān)測在抗病毒治療中的臨床應(yīng)用,HCV病毒感染是可治愈的疾病 HCV RNA檢測可以有效指導(dǎo)臨床用藥 治療的終點是核酸檢測為陰性（核酸檢測可以直接指導(dǎo)停藥時機）,9,行業(yè)傾力,慢性HCV治療方案,10,行業(yè)傾力,慢性HCV治療方案,用藥,12周早期病毒學(xué)反應(yīng),HCV RNA下降2log,HCV病毒檢測陰性,HCV病毒檢測陽性,停藥,HCV病毒檢測陰性,治療到24周HCV RNA檢測,HCV RNA下降2log,繼續(xù)治療至48周,繼續(xù)治療至24周,考慮停藥,11,行業(yè)傾力,國產(chǎn)試劑現(xiàn)狀,目前使用的國產(chǎn)試

5、劑能解決的問題，不能解決的問題： HCV試劑盒說明：5005107 IU/mL 較可信的測試范圍：1045107 IU/mL 注：1 IU/mL= 1 copy/mL,12,行業(yè)傾力,內(nèi) 容,HBV核酸檢測的現(xiàn)狀與需要 HCV核酸檢測的現(xiàn)狀與需要 羅氏的CAP/CTM能帶來什么益處 總結(jié),13,行業(yè)傾力,全世界第一臺用于體外診斷的全自動熒光定量分子診斷系統(tǒng) 真正實現(xiàn) “樣品進，結(jié)果出” 全球安裝超過 2,000臺，國內(nèi)安裝超過 40臺,COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan 系統(tǒng),COBAS AmpliPrep / COBAS TaqMan48系統(tǒng),COBAS AmpliPr

6、ep / COBAS TaqMan 96系統(tǒng)（帶連接系統(tǒng)）,COBAS AmpliPrep / COBAS TaqMan 96系統(tǒng)（無連接系統(tǒng)）,14,行業(yè)傾力,COBAS AmpliPrep儀器簡介,全自動系統(tǒng)，自動進行核酸提取純化和PCR反應(yīng)體系配制 基于MGP磁珠分離技術(shù)，確保高質(zhì)量的核酸提取純化 最多72個樣品可以同時上機，運行中可連續(xù)裝載上架，提高工作效率 包括耗材、樣品、試劑均可以連續(xù)上樣,15,行業(yè)傾力,DNA 或者 RNA,1.裂解、穩(wěn)定和去蛋白,2.核酸捕獲,病毒或細胞,3.沖洗,4.洗脫,37C孵育,COBAS AmpliPrep儀器MGP 磁珠分離技術(shù),室溫,80C孵育,

7、16,行業(yè)傾力,取SPU槍頭 樣本管/反應(yīng)管管蓋抓手 樣本初始體積感應(yīng)器 取試劑鋼針,CAP機械臂介紹,樣本管/反應(yīng)管結(jié)構(gòu),17,行業(yè)傾力,COBAS TaqMan/COBAS TaqMan 48分析儀簡介,檢測通量可達4*24測試 獨立的24孔熱循環(huán)儀 TaqMan 48有2個模塊，TaqMan 96有4個模塊 最多可同時進行4個不同的分析檢測 操作簡單，核酸擴增和檢測全部自動完成 實時定量PCR檢測技術(shù)，卓越的檢測性能，靈敏度高和特異性好，動態(tài)范圍寬,18,行業(yè)傾力,HBV-DNA定量測試用于藥品FDA注冊試驗,INTRON A (Interferon alfa-2b) package i

8、nsert. Schering-Plough Corp. Kenilworth, NJ 2. EPIVIR-HBV (Lamivudine) package insert GlaxoSmithKline, Research Triangle park, NC 3. HEPSERA (Adefovir dipivoxil) package insert Gilead Sciences. Foster City, CA 4. Pegasys (Peginterferon alfa-2a) package insert. Hoffmann-La Roche Inc. Nutley, NJ 5. TY

9、ZEKA (Telbivudine) Package Insert. Novartis Pharmaceuticals Corp. E Hanover, NJ 6. Marcellin P et al. Hep DART 2007 Meeting Abstract 63, Dec 9-13 2007, Lahaina, HI,19,行業(yè)傾力,國外發(fā)表的文獻,Evaluation of initial virological response to adefovir and development of adefovir-resistant mutations in patients with

10、chronic hepatitis B. Gallego et al., Journal of Viral Hepatitis, 2008, 15, 392398 Evaluation of an automated, highly sensitive, real-time PCR-based assay (COBAS AmpliprepTM/COBAS TaqManTM) for quantification of HCV RNA. Christoph Sarrazina et al., Journal of Clinical Virology ,2008, 43, 162168 COBAS

11、 AmpliPrep-COBAS TaqMan Hepatitis B Virus(HBV) Test: a Novel Automated Real-Time PCR Assay for Quantification of HBV DNA in Plasma. Tiziano Allice et al., Journal of Clinical Microbiology, Mar. 2007, p. 828834 Evaluation of the COBAS AmpliPrep-total nucleic acid solation-COBAS TaqMan hepatitis B vir

12、us (HBV) quantitative test and comparison to the VERSANT HBV DNA 3.0 assay. Ronsin C et al., Journal of Clinical Microbiology 2006 vol.44(no.4) Comparison of the COBAS TaqManTM HBV Test With the COBAS Amplicor MonitorTM Test for Measurement of Hepatitis B Virus DNA in Serum. Simon Siu-Man Sum et al.

13、, Journal of Medical Virology 2005, 77:486490 Hepatitis B virus (HBV) genotype determination by the COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 in serum and plasma matrices. Goedel S et al., Journal of Clinical Virology 2009 Jul;45(3):232-6 Comparison of Versant HBV DNA 3.0 and COBAS AmpliPrep-COBAS

14、 TaqMan assays for hepatitis B DNA quantitation : Possible clinical implications. GARBUGLIA A. R. et al., Journal of virological methods 2007, vol. 146, no1-2, pp. 274-280 Performance of the Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan Real-Time PCR Assay for Hepatitis B Virus DNA Quantification. Stephane Chevaliez

15、 et al., Journal of Clinical, May 2008, p. 17161723 ,20,行業(yè)傾力,HBV的定量檢測性能指標(biāo),注：國產(chǎn)試劑1 IU/mL= 1 copy/mL,21,行業(yè)傾力,HCV的定量檢測性能指標(biāo),22,行業(yè)傾力,定量原理外標(biāo)法定量（國產(chǎn)試劑）,使用一組（4管）外部標(biāo)準(zhǔn)品定量，分別為5104到5107 IU/mL 未考慮各患者血液成分間的差異性對結(jié)果的影響,23,行業(yè)傾力,定量原理內(nèi)標(biāo)定量Internal Quantitation Standard(CAP/CTM),內(nèi)標(biāo)是已知拷貝數(shù)的人工構(gòu)建核酸，加入每一反應(yīng)管，與靶核酸競爭擴增，管內(nèi)定量 可提示反應(yīng)

16、是否存在反應(yīng)抑制，避免假陰性結(jié)果 充分考慮管間反應(yīng)效率的差異，得到可靠精確的結(jié)果,24,行業(yè)傾力,COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan系統(tǒng) 封閉樣品管輸入，封閉PCR管輸出 標(biāo)準(zhǔn)化，重復(fù)性,純化好 的核酸,主反應(yīng)液,PCR反應(yīng)體系的配制,試劑、樣品和耗材的裝載上機,樣品處理單元,K-槍頭,K-管,樣品,試劑,25,行業(yè)傾力,Branchburg生產(chǎn)廠房羅氏投資超過1.5億美金，建成全球最大分子診斷試劑生產(chǎn)基地目前每月生產(chǎn)14萬套試劑,26,行業(yè)傾力,羅氏分子診斷嚴格的生產(chǎn)和質(zhì)控體系為整個行業(yè)設(shè)定了高標(biāo)準(zhǔn),1. 原料嚴格把關(guān),3. GMP生產(chǎn),2. 原料質(zhì)檢,4. GMP生產(chǎn)

17、,6. 成品質(zhì)檢,5. 試劑盒成品,7. 資料入檔,27,行業(yè)傾力,COBAS AmpliPrep /COBAS TaqMan全自動熒光定量分子診斷系統(tǒng)的應(yīng)用,抗病毒治療評估和監(jiān)測（HBV/HCV），為臨床醫(yī)生和病人提高更準(zhǔn)確的結(jié)果，指導(dǎo)用藥?？舍槍σ呻y病例、低病毒載量、長期用藥或高端病人 肝移植的術(shù)前術(shù)后監(jiān)控 全國藥物、診斷試劑臨床評估實驗基地 CAP室間質(zhì)評時有與國際接軌的平臺，評價更科學(xué) 基礎(chǔ)研究的工具，文章可信度大大增加,28,行業(yè)傾力,國內(nèi)部分用戶,國內(nèi)用戶現(xiàn)已超過40家,29,行業(yè)傾力,國內(nèi)HBV核酸檢測實例,共檢測21份國產(chǎn)試劑HBV均為陰性的標(biāo)本 其中CAP/CTM HBV仍為陰性者共9份，CAP/