我的基因工程操作程序2

1、二、基因表達載體的構(gòu)建,1、為什么需要構(gòu)建基因表達載體？,2、如果運載體是質(zhì)粒,如何構(gòu)建？,基因表達載體的組成：,目的基因+啟動子+終止子+標記基因+復(fù)制原點,它們有什么作用？,三、將目的基因?qū)胧荏w細胞,1.轉(zhuǎn)化,2.常用的受體細胞,3.將目的基因?qū)胧荏w細胞的原理,借鑒細菌或病毒侵染細胞的途徑。,動植物細胞、大腸桿菌、土壤農(nóng)桿菌、枯草桿菌等。,三、將目的基因?qū)胧荏w細胞,4.方法,將目的基因?qū)?植物細胞,將目的基因?qū)?動物細胞,將目的基因?qū)?微生物細胞,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,基因槍法,花粉管通道法,顯微注射法,感受態(tài)細胞吸收DNA分子,檢測,鑒定,檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA 上是否插入了目

2、的基因,檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA,檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì),抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等,方法,方法,方法,DNA分子雜交,分子雜交（注意與上不同之處）,抗原抗體雜交,四、目的基因的檢測與鑒定,作為基因工程表達載體，只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎？為什么？,不可以。因為目的基因在表達載體中得到表達并發(fā)揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動子、終止子和標記基因等。必須構(gòu)建上述元件的主要理由是： （1） 生物之間進行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動子才能比較有利于基因的表達； （2） 通過cDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動子，只將編碼序列導(dǎo)入受體生物中無法轉(zhuǎn)錄； （3） 目的

3、基因是否導(dǎo)入受體生物中需要有篩選標記； （4） 為了增強目的基因的表達水平，往往還要增加一些其他調(diào)控元件，如增強子等； （5） 有時需要確定目的基因表達的產(chǎn)物存在于細胞的什么部位，往往要加上可以標識存在部位的基因（或做成目的基因與標識基因的融合基因），如綠色熒光蛋白基因等。 即真正被用作載體的質(zhì)粒都需在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進行人工改造， 且受體細胞不同，導(dǎo)入方法不同，均需構(gòu)建。,基因表達載體的構(gòu)建,基因表達載體的功能：使目的基因在受體細胞中存在，并且遺傳給下一代；使目的基因表達和發(fā)揮作用 啟動子：位于基因的首端，它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，啟動轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生mRNA 終止子 ：位于基因的尾端。終止

4、轉(zhuǎn)錄 標記基因：檢測受體細胞是否含有目的基因,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,農(nóng)桿菌特點：易感染雙子葉植物和裸子植物；Ti質(zhì)粒的TDNA可轉(zhuǎn)移至受體細胞，并整合到受體細胞的染色體上。 轉(zhuǎn)化:目的基因插入TDNA農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細胞穩(wěn)定維持和表達,農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法,操作程序： 目的基因表達載體提純?nèi)÷眩ㄊ芫眩?顯微注射體內(nèi)發(fā)育新性狀動物,顯微注射技術(shù),2.微生物作受體細胞原因：,3.轉(zhuǎn)化方法：,大腸桿菌,繁殖快、多為單細胞、遺傳物質(zhì)相對少,處理細胞細胞表達載體與感受態(tài)細胞混合 _細胞吸收DNA分子。,Ca2+,感受態(tài),感受態(tài),1.常用菌：,將目的基因?qū)胛⑸锛毎?采用一定的技術(shù)手段，將兩種生物的DNA分子的單鏈放在一起，如果這兩個單鏈具有互補的堿基序