細胞衰老與凋亡1學(xué)時.ppt

1,第十一章 細胞衰老與凋亡(1學(xué)時）,細胞衰老 (cellular aging或cell senescence) 細胞凋亡(Apoptosis),2,第一節(jié) 細胞衰老 (cellular aging或cell senescence),Hayflick界限(Hayflick Limitation） 細胞在體內(nèi)條件下的衰老 衰老細胞結(jié)構(gòu)的變化 細胞衰老的分子機理,3,一、Hayflick界限(Hayflick Limitation）,概念： 關(guān)于細胞增殖能力和壽命是有限的觀點。細胞，至少是培養(yǎng)的二倍體細胞，不是不死的，而是有一定的壽命；它們的增殖能力不是無限的，而是有一定的界限，這就是 Hayflick界限。 癌細胞或培養(yǎng)的細胞系是不正常細胞，其染色體數(shù)目或形態(tài)已經(jīng)不同于原先的細胞 細胞的增殖能力與供體年齡有關(guān) 物種壽命與培養(yǎng)細胞壽命之間存在著一定的關(guān)系 二倍體細胞的衰老是由細胞本身決定的 決定細胞衰老的因素在細胞內(nèi)部，而不是外部的環(huán)境 是細胞核而不是細胞質(zhì)決定了細胞衰老,4,不同年齡來源的人成纖維細胞的增殖代數(shù),5,二、細胞在體內(nèi)條件下的衰老,在機體內(nèi)，細胞的衰老和死亡是常見的現(xiàn)象，甚至在個體發(fā)育的早期也會發(fā)生; 正常情況下終生保持分裂的細胞，其分裂能力是否隨著有機體年齡的增高而下降？它們 會不會衰老？ 衰老動物體內(nèi)，細胞分裂速度顯著減慢，其原因主要是G1期明顯延長; 衰老個體內(nèi)的環(huán)境因素影響了細胞的增殖和衰老; 骨髓干細胞移植實驗說明隨著年齡的增加，干細胞增殖速度也趨緩慢.,6,三、衰老細胞結(jié)構(gòu)的變化,細胞核的變化： 體外培養(yǎng)的二倍體細胞，細胞核隨著細胞分裂次數(shù)的增加不斷增大； 細胞核的核膜內(nèi)折（invagination）、染色質(zhì)固縮化； 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的變化： 衰老動物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)成分彌散性地分散于核 周胞質(zhì)中，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的總量似乎是減少了； 線粒體的變化： 通常細胞中線粒體的數(shù)量隨齡減少，而其體積則隨齡增大； 致密體的生成：脂褐質(zhì)，老年色素等 膜系統(tǒng)的變化： 衰老的細胞，其膜流動性降低、韌性減小。 衰老細胞間間隙連接減少；細胞膜內(nèi)（P面）顆粒的分布也發(fā)生變化（減少）。,7,四、細胞衰老的分子機理, 氧化性損傷學(xué)說：代謝過程中產(chǎn)生的活性氧基團或分子（ROS-O2-， OH- ， H2O2 ），引發(fā)的氧化性損傷的積累，最終導(dǎo)致衰老。 端粒與衰老：發(fā)現(xiàn)端粒長度確實與衰老有著密切的關(guān)系，提出細胞衰老的 “有絲分裂鐘”學(xué)說（Harley,1990） rDNA與衰老: 酵母染色體外rDNA 環(huán)（ERC）的積累，導(dǎo)致細胞衰老。 沉默信息調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物（Sir complex）與衰老：Sir complex 存在于異染色質(zhì)區(qū)，其作用在于阻斷所在位點DNA轉(zhuǎn)錄。 SGS1基因和WRN基因與衰老： SGS1基因和WRN基因同源,編碼解旋酶; 酵母sgs1突變體壽命明顯短于野生型（平均9.5代:24.5代）; wrn突變 引發(fā)早老癥. 發(fā)育程序與衰老: 線粒體DNA與衰老: Sen-DNA(80年代);mtDNA突變積累與細胞衰老有關(guān).,8,第二節(jié) 細胞凋亡(Apoptosis),細胞凋亡的概念及其生物學(xué)意義 細胞凋亡的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征 細胞凋亡的分子調(diào)控機理,9,一、細胞凋亡的概念及其生物學(xué)意義,概念：細胞凋亡是一個主動的由基因決定的自動結(jié)束生命的過程，所以也常常被稱為細胞編程死亡（programmed cell death, PCD）。凋亡細胞將被吞噬細胞吞噬。 生物學(xué)意義：細胞凋亡對于多細胞生物個體發(fā)育的正常進行，自穩(wěn)平衡的保持以及抵御外界各種因素的干擾方面都起著非常關(guān)鍵的作用： 蝌蚪尾的消失，骨髓和腸的細胞凋亡， 脊椎動物的神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育， 發(fā)育過程中手和足的成形過程。,10,二、細胞凋亡的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征,細胞凋亡與壞死(necrosis) 細胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征 細胞凋亡的生化特征 誘導(dǎo)細胞凋亡的因子 細胞凋亡的檢測,11,細胞凋亡與壞死(necrosis),二者的主要區(qū)別是： 細胞凋亡過程中，細胞質(zhì)膜反折，包裹斷裂的染色質(zhì)片段或細胞器，然后逐漸分離，形成眾多的凋亡小體（apoptotic bodies），凋亡小體則為鄰近的細胞所吞噬。整個過程中，細胞質(zhì)膜的整合性保持良好，死亡細胞的內(nèi)容物不會逸散到胞外環(huán)境中去，因而不引發(fā)炎癥反應(yīng)。 相反，在細胞壞死時，細胞質(zhì)膜發(fā)生滲漏，細胞內(nèi)容物，包括膨大和破碎的細胞器以及染色質(zhì)片段，釋放到胞外，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。,12,細胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征,凋亡的起始： 細胞表面的特化結(jié)構(gòu)如微絨毛消失，細胞間接觸的消失，但細胞膜依然完整；線粒體大體完整，但核糖體逐漸從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上脫離，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊腔膨脹，并逐漸與質(zhì)膜融合；染色質(zhì)固縮，形成新月形帽狀結(jié)構(gòu)等形態(tài)，沿著核膜分布 凋亡小體的形成： 核染色質(zhì)斷裂為大小不等的片段，與某 些細胞器如線粒體一起聚集，為反折的細胞質(zhì)膜所包圍。細胞表面產(chǎn)生了許多泡狀或芽狀突起，逐漸形成單個的凋亡小體 凋亡小體逐漸為鄰近的細胞吞噬并消化,13,細胞凋亡的生化特征,細胞凋亡的主要特征是形成大小為180200bp特征性的DNA ladders 凋亡細胞組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶tTG（tissue Transglutaminase）積累并達到較高水平,14,誘導(dǎo)細胞凋亡的因子,物理性因子，包括射線（紫外線， 射線等），較溫和的溫度刺激（如熱激，冷激）等。 化學(xué)及生物因子：包括活性氧基團和分子，DNA和蛋白質(zhì)合成的抑制劑，激素，細胞生長因子，腫瘤壞死因子（TNF），抗Fas/Apo-1/CD95抗體等,15,細胞凋亡的檢測,形態(tài)學(xué)觀測：染色法、透射和掃描電鏡觀察 DNA電泳：DNA片段就呈現(xiàn)出梯狀條帶 TUNEL測定法，即DNA斷裂的原位末端標記法 細胞凋亡中, 染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標記法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。 彗星電泳法（comet assay） 流式細胞分析 根據(jù)凋亡細胞DNA斷裂和丟失，采用碘化丙啶使DNA 產(chǎn)生激發(fā)熒光，用流式細胞儀檢出凋亡的亞二倍體細 胞，同時又能觀察細胞的周期狀態(tài)。,16,三、細胞凋亡的分子調(diào)控機理,對哺乳動物細胞凋亡的基因凋控過程目前還不十分清楚，研究表明與細胞增殖有關(guān)的原癌基因和抑癌基都參于對細胞凋亡的凋控。其中研究較多的有bcl-2 c-myc、p53、Ice、Fas/APO-1等。 線蟲(C.elegans)凋亡研究發(fā)現(xiàn)ced3,ced4基因促進細胞凋亡，ced9基因阻止ced3/ced4的激活，抑制細胞凋亡。Ced3哺乳類同源物是ICE(Interleukin-1-converting enzyme)，即Caspase1 Caspase家族與凋亡 Bcl-2家族、線粒體與細胞凋亡 p53與細胞凋亡 是一種抑癌基因，其生物學(xué)功能是在G期監(jiān)視DNA的完整性。如有損傷，則抑制細胞增殖。直到DNA修復(fù)完成。,17,Caspase家族與凋亡,Caspase家族 Caspase是近年來發(fā)現(xiàn)的一組存在與細胞質(zhì)中的結(jié)構(gòu)上相關(guān)的半胱氨酸蛋白酶，其活性位點是半胱氨酸(Cysteine)，裂解靶蛋白位點是天冬氨酸殘基后的肽鍵，因此稱為Cysteine aspartic acic specific protease，即Caspase Caspase活化 Caspase自身以非活化的Procaspase存在，其激活依賴于其他的Caspase在它的天冬氨酸位點裂解活化或自身活化 胞外信號分子誘導(dǎo)的細胞凋亡途徑,18,胞外信號分子誘導(dǎo)的細胞凋亡途徑,凋亡信號通路 當(dāng)細胞接受凋亡信號分子(Fas,TNF等)后，凋亡細胞表面信號分子受體相互聚集并與細胞內(nèi)的銜接蛋白(Adaptor protein)結(jié)合，這些銜接蛋白又募集Procaspases聚集在受體部位，Procaspase相互活化并產(chǎn)生級聯(lián)反應(yīng)，使細胞凋亡 下游Caspases活化后，作用底物：裂解核纖層蛋白，導(dǎo)致細胞核形成凋亡小體； 裂解DNase結(jié)合蛋白，使DNase釋放，降解DNA形成DNA Ladder 裂解參與細胞連接或附著的骨架和其他蛋白，使凋亡細胞皺縮、脫落，便于細胞吞噬； 導(dǎo)致膜脂PS重排，便于吞噬細胞識別并吞噬。,19,Bcl-2家族、線粒體與細胞凋亡,Bcl-2是一種原癌基因，是ced-9在哺乳類中的同源物，能抑制細胞凋亡；與線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜相結(jié)合；Bcl-2蛋白的羧基末端有一穿膜的結(jié)構(gòu)域；Bcl-2家族成員的基因中，常常含有三個保守的Bcl-2同源區(qū)，即BH1，BH2和BH3 Bcl-2、線粒體與細胞凋亡 當(dāng)Caspase8活化后，它一方面作用于Procaspase3，另一方面使Bid裂解成2個片段，其中含BH3結(jié)構(gòu)域的C-端片段被運送到線粒體，與Bcl-2/Bax的BH3結(jié)構(gòu)域形成復(fù)合物，導(dǎo)致細胞色素C釋放。CytC與胞質(zhì)中Ced4同源物Apaf-1(凋亡蛋白酶活化因子apoptosis protease activating factor)結(jié)合并活化Apaf-1，活化的Apaf-1再活化Procaspase9，最后引起細胞凋亡。 哺乳動物細胞中發(fā)現(xiàn)的Apaf2即是CytC,20,21,22,a 正常T細胞雜交瘤細胞 b 凋亡細胞(掃描電鏡) c 凋亡細胞(透射電鏡),23,BCL-2家族成員,24,25,26,壞死細胞,凋亡細胞,27,28,細胞色素c誘導(dǎo)的凋亡細胞DNA電泳圖 1細胞色素c誘導(dǎo)0 h 2細胞色素c誘導(dǎo)1 h 3細胞色素c誘導(dǎo)2 h 4細胞色素c誘導(dǎo)3 h 5細胞色素c誘導(dǎo)4 h 6陰性對照 7Marker （ 自趙允、翟中和）,29,線蟲Caenorhabditis elegans 是研究個體發(fā)育和細胞程序性死亡的理想材料。其生命周期短，細胞數(shù)量少，成熟的成蟲若是雌雄同體則有959個體細胞，約2000個生殖細胞。若是雄蟲則有1031個體細胞和約1000個生殖細胞。神經(jīng)系統(tǒng)由302個細胞組成。這些細胞來自于407個前體細胞。這些前體細胞中有105個發(fā)生了程序死亡?？刂凭€蟲細胞凋亡的基因主要有3個Ced-3、Ced-4和Ced-9，Ced-3和