花藥與花粉培養(yǎng).ppt

第 五 章 花藥與花粉培養(yǎng),第一節(jié) 花藥與花粉培養(yǎng)的概念及意義 一、花藥與花粉培養(yǎng)的概念 花藥是植物花的雄性器官，包括二倍性的藥壁和藥隔組織以及單倍性的雄性性細(xì)胞花粉粒。 （一）花藥培養(yǎng)： 是把整個(gè)花藥接種到培養(yǎng)基上，在離體培養(yǎng)條件下，分裂、分化，最終發(fā)育成完整植株的過(guò)程?；ㄋ幣囵B(yǎng)的外植體是植物雄性生殖器官的一部分。,（二）花粉培養(yǎng)： 是把花粉(小孢子)從花藥中分離出米，接種到培養(yǎng)基上，在離體培養(yǎng)條件下，誘導(dǎo)形成單倍體的孢子體的過(guò)程?；ǚ叟囵B(yǎng)是將花粉從花藥中游離出來(lái)，成為分散或游離態(tài)進(jìn)行培養(yǎng)。,二、花藥和花粉培養(yǎng)的意義 作物單倍體只具有單套染色體組，本身沒(méi)有或很少有育種價(jià)值，但經(jīng)染色體加倍成為雙倍體后，與常規(guī)育種有機(jī)結(jié)合，就會(huì)顯示出巨大的優(yōu)勢(shì)。而作物單倍體尤其是雙單倍體與分子生物學(xué)、基因工程的密切結(jié)合，可使作物育種發(fā)生革命性的變化。,(一) 作物育種能迅速獲得純合體 (二)物種進(jìn)化研究 （三）體細(xì)胞融合 (四)遺傳分析 (五)分子生物學(xué)研究 (六)植物基因克隆篩選,第二節(jié) 離體條件下的小孢子發(fā)育 一、離體小孢子發(fā)育途徑 在自然條件下被子植物雄配子的形成過(guò)程是： 孢原組織 花粉母細(xì)胞(減數(shù)分裂)四分孢子單核花粉粒(有絲分裂)二核花粉粒(1個(gè)營(yíng)養(yǎng)核和1個(gè)生殖核) 生殖核再經(jīng)過(guò)一次有絲分裂形成3核的成熟花粉粒(1個(gè)營(yíng)養(yǎng)核和2個(gè)生殖核)或稱雄配子體,在離體培養(yǎng)條件下，由于改變了花粉原來(lái)的生活環(huán)境，花粉的正常發(fā)育途徑受到抑制，由第一次分裂形成的花粉不再像正常發(fā)育過(guò)程中那樣由生殖核再分裂一次形成2個(gè)精子核，而是像胚細(xì)胞一樣持續(xù)分裂增殖。根據(jù)對(duì)多種植物花藥或花粉培養(yǎng)的觀察，發(fā)現(xiàn)小孢子的發(fā)育途徑主要有對(duì)稱發(fā)育途徑和不對(duì)稱發(fā)育途徑2類。,(一)對(duì)稱發(fā)育途徑 小孢子第一次有絲分裂為均等分裂，形成兩個(gè)相同的核，并接著發(fā)生細(xì)胞壁經(jīng)小孢子分割成兩個(gè)大小相似的細(xì)胞。這兩個(gè)細(xì)胞倘若在以后的幾次分裂中是同步的，則大多數(shù)以胚狀體的形式形成花粉胚；倘若這兩個(gè)細(xì)胞再次分裂不同步，其中一個(gè)停止分裂，另一個(gè)經(jīng)過(guò)相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間的持續(xù)分裂，則形成愈傷組織；再倘若這兩個(gè)細(xì)胞在進(jìn)行多次核分裂的同時(shí)，發(fā)生核融合，其結(jié)果產(chǎn)生多倍體植株 。,(二)不對(duì)稱發(fā)育途徑 同自然情況一樣，小孢子第一次有絲分裂為不均等分裂，在花粉內(nèi)形成一個(gè)較大的營(yíng)養(yǎng)核和一個(gè)較小的生殖核。根據(jù)兩個(gè)核進(jìn)一步發(fā)育狀況，該途徑又分為生殖細(xì)胞發(fā)育途徑、營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞發(fā)育途徑、營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞并發(fā)發(fā)育途徑3種：,1、生殖細(xì)胞發(fā)育途徑 營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)幾次分裂后便停止分裂，由生殖細(xì)胞繼續(xù)分裂，形成多細(xì)胞的(或稱多核)花粉，進(jìn)一步發(fā)育形成愈傷組織或胚狀體 2、營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞發(fā)育途徑。 生殖細(xì)胞經(jīng)幾次分裂后便停止分裂，由營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞繼續(xù)分裂，形成多細(xì)胞的(或稱多核)花粉，進(jìn)一步發(fā)育形成愈傷組織或胚狀體 3、營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞并發(fā)發(fā)育途徑。 營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞分別進(jìn)行分裂，形成多細(xì)胞的(或稱多核)花粉，進(jìn)一步發(fā)育形成愈傷組織或胚狀體。,小孢子正常發(fā)育途徑與離體培養(yǎng)條件下胚胎發(fā)育途徑比較,A:第一次有絲分裂為非均等分裂，形成一個(gè)營(yíng)養(yǎng)核、一個(gè)生殖核 A-v:營(yíng)養(yǎng)核重復(fù)分裂而生殖核敗育 A-G:生殖核重復(fù)分裂而營(yíng)養(yǎng)核敗育 A-VG:生殖核和營(yíng)養(yǎng)核共同分裂 C:營(yíng)養(yǎng)核、生殖核分別或同時(shí)進(jìn)行核內(nèi)復(fù)制，有絲分裂后核融合分別形成二倍體、三倍體、四倍體胚 B:第一次有絲分裂為均等分裂，形成兩個(gè)相似的營(yíng)養(yǎng)型核，進(jìn)而重復(fù)分裂形成單倍體胚或先核融合然后重復(fù)分裂形成多倍體胚 D:自然條件下小孢子的第二次分裂、淀粉粒及萌發(fā)形成的花粉管（即正常發(fā)育途徑）,二、影響離體小孢子發(fā)育的因素 影響離體小孢子發(fā)育的因素主要有供體植株的基因型、供體植株的生長(zhǎng)條件和生理狀態(tài)、供體植株的年齡、小孢子發(fā)育時(shí)期、培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件等。 （一）供體植株的基因型 供體植株的基因型是影響花藥和花粉培養(yǎng)的最重要的因素之一。一般來(lái)說(shuō)裸子植物比較困難，而被子植物相對(duì)比較容易；同一物種不同品種間，甚至同一品種的不同株系間，花藥和花粉培養(yǎng)的難易程度也大不相同。,（二）生理狀態(tài) 供體植株的年齡及其所處的生長(zhǎng)條件也能影響花藥對(duì)離體培養(yǎng)的反應(yīng)。一般來(lái)說(shuō)，幼年植株的花藥反應(yīng)能力較好。在開(kāi)花末季采集的花藥不但形成孢子體的頻率很低，而且發(fā)生反應(yīng)的時(shí)間也較遲。在水稻和小麥等禾谷類植物中，大田植株比溫室植株、主莖穗比分蘗穗花粉愈傷組織的誘導(dǎo)率高。,（三）培養(yǎng)基成分 花藥和花粉培養(yǎng)所用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基以MS最為普遍，其次是B5和N6培養(yǎng)基，其中N6培養(yǎng)基特別適合水稻的花藥培養(yǎng)。 不同植物種類及品種間所需的培養(yǎng)基成分存在很大差異。有些植物只需很簡(jiǎn)單的培養(yǎng)基，例如煙草的花藥培養(yǎng)，即使在僅含有蔗糖和螯合鐵的溶液中，也可誘導(dǎo)部分花粉啟動(dòng)、形成少量的胚狀體。而對(duì)于大多數(shù)植物來(lái)說(shuō)，則需要較為復(fù)雜的培養(yǎng)基成分。,（四）藥壁因子 大量的證據(jù)表明，在花粉胚發(fā)育過(guò)程中花藥壁起著重要的作用。 (五)花粉發(fā)育時(shí)期 在花藥和花粉培養(yǎng)過(guò)程中，小孢子所處的發(fā)育時(shí)期是影響培養(yǎng)效果的重要因素。只有處于一定發(fā)育階段的小孢子，才能對(duì)外界刺激較為敏感，從而改變其發(fā)育途徑，由配子體轉(zhuǎn)向孢子體方向，從而產(chǎn)生愈傷組織或胚狀體。,不同植物花藥或花粉培養(yǎng)的取材時(shí)期,(六)預(yù)處理 對(duì)花蕾或花藥進(jìn)行預(yù)處理，能有效地促進(jìn)花粉愈傷組織或胚狀體形成，提高培養(yǎng)的成功率。常用的預(yù)處理措施主要是低溫處理和熱激處理。低溫預(yù)處理是指在培養(yǎng)之前，將材料置低溫條件下(014)處理一段時(shí)間再進(jìn)行接種。熱激處理則是指將接種后的花藥或花粉置于高溫條件下(3035)培養(yǎng)一段時(shí)間，然后再移至正常溫度下繼續(xù)培養(yǎng)。,(七)培養(yǎng)條件 1、溫度 對(duì)任何培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)的最適溫度都因物種而異?；ㄋ幒突ǚ叟囵B(yǎng)的溫度一般以25為宜，但也有些植物對(duì)溫度有特殊的要求。 2、光照 誘導(dǎo)愈傷組織一般不需要光照，但光照有助于器官的分化。雖然在某些植物中，無(wú)論有無(wú)光照都能形成花粉植株，但在光照下植株的形成頻率較高，生長(zhǎng)也更健壯。 3、植板密度 花粉培養(yǎng)中，接種的花粉密度和分化培養(yǎng)時(shí)愈傷組織或細(xì)胞團(tuán)植板密度對(duì)植株生根有很大影響。,第三節(jié) 花藥與花粉培養(yǎng)的技術(shù) 一、花藥培養(yǎng)的方法 花藥培養(yǎng)是指在離體條件下，對(duì)完整花藥進(jìn)行培養(yǎng)的技術(shù)。從組織器官角度來(lái)說(shuō)，它屬于器官培養(yǎng)的范疇?；ㄋ幣囵B(yǎng)的方法大致可分為以下幾個(gè)步驟：,(一) 取材 是花藥或花粉培養(yǎng)成功的基礎(chǔ)。大量的實(shí)驗(yàn)表明，培養(yǎng)內(nèi)含減數(shù)分裂期至雙核期花粉的花藥，均有可能誘導(dǎo)形成單倍體植株，但最佳時(shí)期則依物種類或品種不同而異，大多數(shù)為單核中、晚期。接種前，通常先用醋酸洋紅染色壓片法鏡檢，以確定花粉的發(fā)育時(shí)期，并找出花粉發(fā)育時(shí)期與花蕾大小等表觀特征的相互關(guān)系。然后取適宜時(shí)期的花蕾作為接種材料。,（二）預(yù)處理 適當(dāng)?shù)念A(yù)處理可以顯著提高花藥的愈傷組織誘導(dǎo)率。常用的預(yù)處理方法是低溫冷藏，具體的處理溫度和時(shí)間長(zhǎng)度因物種而異： 煙草79，714 天； 水稻710，1015 天； 黑麥13，714 天； 大麥3-7，714天。 但低溫預(yù)處理對(duì)小麥效果不穩(wěn)定，有時(shí)還有負(fù)效果。,(三) 材料滅菌 在無(wú)菌條件下，先將花蕾用70%酒精浸泡30秒左右，再用0.1%氯化汞表面消毒810分鐘，或用1%的次氯酸鈉消毒1015分鐘，然后用無(wú)菌水沖洗35次。,(四) 接種培養(yǎng) 無(wú)菌條件下將花藥從花蕾中取出，直接接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。取花藥時(shí)，應(yīng)注意盡量避免損傷花藥，以免從受傷處產(chǎn)生藥壁愈傷組織；另外還要注意徹底去除花絲部分，因?yàn)榻臃N與花絲相連的花藥時(shí)，往往不利于花藥內(nèi)小孢子的啟動(dòng)，以及愈傷組織或胚狀體的形成?；ㄋ幣囵B(yǎng)的方式有固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)2種。 花藥培養(yǎng)一般是先暗培養(yǎng)，待愈傷組織形成后，再轉(zhuǎn)入光照條件下培養(yǎng)，促進(jìn)器官分化。光照時(shí)間和培養(yǎng)溫度因培養(yǎng)材料而異。,（五）壯苗和移栽 花藥植株非常嬌嫩很難移栽，需采用逐步過(guò)渡的方式，使其適用從異養(yǎng)到自養(yǎng)，因此，要通過(guò)壯苗階段。移栽的關(guān)鍵是保持高空氣濕度（80%90%）12周和低土壤濕度。,選幼年樹(shù)花蕾,消毒接種培養(yǎng),（單核期，或單核中晚期）,花藥培養(yǎng)流程,二、花粉培養(yǎng)的方法 花粉培養(yǎng)（小孢子培養(yǎng)），即未成熟花粉的培養(yǎng)，是指在離體條件下，對(duì)游離的小孢子進(jìn)行培養(yǎng)的技術(shù)。與花藥培養(yǎng)相比，操作較為復(fù)雜，從組織器官角度來(lái)說(shuō)，花粉培養(yǎng)屬于細(xì)胞培養(yǎng)的范疇。 花粉培養(yǎng)的全過(guò)程除了材料的選擇、滅菌與花藥培養(yǎng)基本相同外，還包括小孢子的分離、純化和培養(yǎng)3個(gè)步驟。,(一) 小孢子的分離 小孢子的分離有自然散落法、擠壓法和機(jī)械法等3種： 1.自然散落法。 花藥消毒后，無(wú)菌條件下取出花藥，接種在液體培養(yǎng)基中，當(dāng)花藥自然開(kāi)裂、釋放出花粉后，去除花藥壁，繼續(xù)培養(yǎng)或離心收集花粉后培養(yǎng)。,2.擠壓法。 花藥消毒后，置無(wú)菌培養(yǎng)皿或小燒杯中，加入少量小孢子提取液或培養(yǎng)液，用平頭大玻棒或注射器內(nèi)管輕輕擠壓，使花粉釋放出來(lái)，此法簡(jiǎn)便易行，是少量分離小孢子常用的方法，但不適宜大規(guī)模游離小孢子的操作。,3.機(jī)械游離法。 有磁攪拌和小型攪拌2種，前者將花粉置于裝有小孢子提取液或培養(yǎng)液的三角瓶中，放入一根磁棒，至磁力攪拌器上，低速旋轉(zhuǎn)使花粉釋放出來(lái)。該法分離花粉比較徹底，但對(duì)花粉有不同程度的機(jī)械損傷。后者將花藥放入小型攪拌器中，加入適量的小孢子提取液或培養(yǎng)液。通過(guò)高速運(yùn)轉(zhuǎn)，帶動(dòng)花蕾花藥高速運(yùn)動(dòng)而破碎，使小孢子游離出來(lái)。,(二) 小孢子的純化 小孢子分離出來(lái)以后，需要經(jīng)過(guò)純化才能獲得純凈的小孢子。純化的一般方法是將分離出的小孢子用一定孔徑的尼龍網(wǎng)膜過(guò)濾到離心管里，于500-1000r/分鐘下離心2-3分鐘，去掉上清液；再加入小孢子清洗液，重新懸浮小孢子，離心1-2分鐘，重復(fù)清洗2-3次，最后倒出上清液，向離心管中加入液體培養(yǎng)基，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將小孢子調(diào)整到一定密度，進(jìn)行分裝、培養(yǎng)。,(三) 小孢子的培養(yǎng) 小孢子培養(yǎng)主要有淺層培養(yǎng)、平板培養(yǎng)、雙層培養(yǎng)、看護(hù)培養(yǎng)、懸滴培養(yǎng)、條件培養(yǎng)等方法。 其中，淺層培養(yǎng)和平板培養(yǎng)2種方法較為常用?，F(xiàn)簡(jiǎn)要介紹雙層培養(yǎng)和懸滴培養(yǎng)。,選幼年樹(shù)花蕾,取下花蕾（鏡檢）,取花藥,藥壁向花粉提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)； 通過(guò)藥壁吸收、貯存和轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中的外源物質(zhì),消毒,過(guò)濾離心,再生,花粉培養(yǎng)流程,小孢子培養(yǎng)的優(yōu)越性 排除了藥壁、藥隔、花絲等體細(xì)胞組織的干擾，獲得的再生植株都是來(lái)源于單倍體的小孢子(花粉)； 花藥培養(yǎng)中，有時(shí)會(huì)因花藥中的某些物質(zhì)而影響小孢子的啟動(dòng)分裂，而小孢子培養(yǎng)則不存在這種問(wèn)題； 小孢子培養(yǎng)中，由于小孢子是游離的單倍體細(xì)胞，除不受等位基因影響外，能均勻地接觸外部環(huán)境條件(如化學(xué)、物理誘變)，因此是研究轉(zhuǎn)化和誘變的理想材料； 便于系統(tǒng)觀察小孢子在離體條件下的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，是研究發(fā)育極好的材料體系： 小孢子培養(yǎng)從每個(gè)花藥中能獲得更多的再生植株。,三、 單倍體植株鑒定及染色體加倍 （一）單倍體植株鑒定方法 1染色體直接計(jì)數(shù)法： 通過(guò)植株的根尖或莖尖等細(xì)胞分裂旺盛處的細(xì)胞染色體直接計(jì)數(shù)是最有效的方法。 2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定法 葉片保衛(wèi)細(xì)胞的大小、單位面積上的氣孔數(shù)及保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體的大小和數(shù)目與倍性具有高度的相關(guān)性。,3植株形態(tài)學(xué)鑒定法 不同倍性的植株在形態(tài)上有比較明顯的差別，主要表現(xiàn)在子葉、真葉、花等的形狀、大小和顏色，開(kāi)花結(jié)實(shí)性，花粉著色能力及大小，果實(shí)形狀及種子的形態(tài)等。 4流式細(xì)胞儀鑒定 流式細(xì)胞儀可迅速測(cè)定葉片單個(gè)細(xì)胞的DNA含量，進(jìn)而根據(jù)DNA含量曲線圖推斷細(xì)胞的倍性。,5生化或分子標(biāo)記鑒定法 （1） 生化標(biāo)記鑒定。 主要是用同工酶對(duì)再生植株來(lái)源和倍性鑒定。 （2）分子標(biāo)記鑒定。 可用來(lái)鑒定再生植株 來(lái)源和倍性。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，不斷涌現(xiàn)的各種分子標(biāo)記技 術(shù)(如RFLP、RAPD、AFLP、SSR等)作為遺傳育種的重要手段得到了廣泛應(yīng)用。,6雜交鑒定法 分為自交鑒定和測(cè)交鑒定。前者適用于自花授粉植物，自交后代群體分離則該二倍體為雜合二倍體，否則為純合二倍體。有時(shí)也利用四倍體自交結(jié)實(shí)率較低的特性鑒定四倍體植株。測(cè)交鑒定適用于雌雄異株的植物，如石刁柏、啤酒花、獼猴桃等。方法是使雄株和雌株雜交，從F1分離比例來(lái)判斷親代雄株的基因型，從而判斷雄親是來(lái)自小孢子還是體細(xì)胞。,(二) 單倍體植株的染色體加倍 單倍體植株弱小、不育，沒(méi)有直接的利用價(jià)值，只有經(jīng)過(guò)染色體加倍，使之成為二倍體的可育植株，才能應(yīng)用于育種。單倍體植株的染色體加倍主要有以下3種途徑。 1自然加倍 在誘導(dǎo)形成單倍體植株的過(guò)程中，往往有一些植株會(huì)自然加倍。,2人工誘導(dǎo)加倍 盡管在花藥和花粉培養(yǎng)中，單倍體可以自然加倍成二倍體，但對(duì)自然加倍率較低的一些植物來(lái)說(shuō)，僅靠單倍體的自然加倍，不能滿足育種實(shí)踐的