血清堿性磷酸酶活性測(cè)定(第一組).ppt

血清堿性磷酸酶活性測(cè)定,磷酸本二鈉法,酶活力測(cè)定與酶法分析,酶活力測(cè)定 酶活力：即是酶活性，是表示催化某一特定反應(yīng)的能力?？梢杂迷谝欢l件下所催化的某一特定化學(xué)速度表示。 酶催化反應(yīng)速度越快，酶活性 ，反之則愈低。 底物減少量或生成物增加量 酶促反應(yīng)速度= 單位時(shí)間,影響酶促反應(yīng)速度的因素包括底物濃度、酶濃度、ph值、溫度、激活劑、抑制劑等。 酶活力單位指：在特定條件下1分鐘能將1微摩爾底物轉(zhuǎn)化為底物所需酶量，或轉(zhuǎn)化底物中1微摩爾的有關(guān)基團(tuán)的酶數(shù)。 酶的比活力：?jiǎn)挝毁|(zhì)量酶蛋白或單位體積酶制劑所含有酶活力單位數(shù)。 方法： 1.終止測(cè)定法（定時(shí)法或終點(diǎn)法） 2.動(dòng)力學(xué)分析法（連續(xù)監(jiān)測(cè)法或速率法） 3.物質(zhì)含量的測(cè)定方法,酶法分析 ！指應(yīng)用酶作為工具定量測(cè)定某種物質(zhì)含量的分析方法。 （一）單酶反應(yīng)定量法 1、直接測(cè)定底物的含量 2、由輔酶變化量測(cè)定底物量 （二）偶聯(lián)酶反應(yīng)定量法 E1 E2 A B C,酶活力測(cè)定和酶法分析在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1.熟悉酶活性測(cè)定方法的一般原理 2.掌握血清ALP測(cè)定原理與臨床意義 3.熟悉終止法和動(dòng)力學(xué)測(cè)定法,實(shí)驗(yàn)原理 在PH10 環(huán)境中，ALP催化磷酸苯二鈉水解生成苯酚和磷酸氫二鈉，苯酚與4-氨基安替比林反應(yīng)生成色素原，該色素原經(jīng)鐵氰化鉀氧化生成紅色醌亞衍生物。測(cè)定紅色物質(zhì)的吸光度就可以計(jì)算酶活性的大小。 反應(yīng)式如下： 磷酸苯二鈉+H2O苯酚+磷酸氫二鈉 苯酚+4-氨基安替比林紅色醌亞胺衍生物,實(shí)驗(yàn)器材和試劑： （一）器材： 5ml移液管，1ml移液管，100或200ul微量可調(diào)式移液器，721E分光光度計(jì)，1cm比色皿，37 恒溫水浴 （二）試劑： 10.1mol/L碳酸鹽緩沖液(pH10.0) 稱取無(wú)水碳酸鈉6.36g，碳酸氫鈉3.36g，4-氨基安替比林1.5g，溶于800ml蒸餾水中，定容至1L。置棕色瓶中保存。 220mmol/L磷酸苯二鈉溶液 先將500ml蒸餾水煮沸，稱取磷酸苯二鈉2.18g(磷酸苯二鈉如含2分子結(jié)晶水，則應(yīng)稱取2.54g)加入煮沸的蒸餾水中使其溶解，冷卻后用煮過(guò)的冷蒸餾水加至500ml，再加氯仿2ml，置冰箱保存，此為底物溶液。 3鐵氰化鉀的硼酸溶液 稱取鐵氰化鉀2.5g，硼酸17g，各自溶于蒸餾水400ml中，兩液混合后，加蒸餾水至1 000ml，置棕色瓶中避光保存(如出現(xiàn)藍(lán)綠色即棄去)。 4酚標(biāo)準(zhǔn)工作液（0. 05mg/ml）：購(gòu)買合格的二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品。,實(shí)驗(yàn)操作,取試管4支，按下表操作：,立即混勻。用510nm波長(zhǎng)比色，以蒸餾水調(diào)零點(diǎn)，讀取各管吸光度。 計(jì)算 ALP活性=（A測(cè)定A對(duì)照）/（A標(biāo)準(zhǔn)A空白）*0.05*100(金氏單位）,臨床意義 在臨床上，血清ALP測(cè)定常作為肝膽疾病和骨骼疾病的臨床輔助診斷指標(biāo)。 1血清ALP活性升高 ： 肝膽疾?。鹤枞渣S疸、急性或慢性黃疸性肝炎、肝癌等；骨骼疾?。河捎诠堑膿p傷或疾病使成骨細(xì)胞內(nèi)所含高濃度的ALP釋放進(jìn)入血液中，引起血清ALP活性增高，如纖維性骨炎、成骨不全癥、佝僂病、骨軟化病、骨轉(zhuǎn)移癌和骨折修復(fù)愈合期等。 2血清ALP活性降低： 比較少見(jiàn)，主要見(jiàn)于呆小病，ALP過(guò)少癥，維生素C缺乏癥。,注意事項(xiàng) 1底物溶液中不應(yīng)含有游離酚，如有酚則空白管顯紅色，說(shuō)明磷酸苯二鈉已經(jīng)開(kāi)始分解，應(yīng)棄去不用。 2鐵氰化鉀溶液中加入硼酸有穩(wěn)定顯色作用。該液應(yīng)避光保存，如出現(xiàn)藍(lán)綠色即應(yīng)廢棄。 3加入鐵氰化鉀溶液后必須立即混勻，否則顯色不完全。 4黃疸血清及溶血血清應(yīng)分別作對(duì)照管，一般血清標(biāo)本可以共用對(duì)照管,標(biāo)準(zhǔn)曲線法 制備如下： 取試管6支，分別加酚標(biāo)準(zhǔn)液(1ml=01mg)，0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4ml，各管依次加復(fù)合基質(zhì)液3.1、3.05、3.0、2.9、2.8、2.7ml?；靹蚝?7水浴保溫5分鐘，各管加入1.0ml堿性溶液，再加0.5鐵氰化鉀2.0ml