M-O真核生物的轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄調(diào)控.ppt

M 真核生物的轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄調(diào)控, 真核生物RNA聚合酶,真核細(xì)胞的三種RNA聚合酶特征比較,第一節(jié) 真核生物的轉(zhuǎn)錄,RNA聚合酶亞基,每種RNA聚合酶均含有12個(gè)或更多的不同亞基 每種RNA聚合酶均含有類似于E.Coli core RNA polymerase的亞基，最大的兩個(gè)亞基彼此相似，并與E.coli RNA聚合酶的和 亞基相似，其他亞基與E.coli 聚合酶中的a亞基具有同源性。 另外還有五種亞基在這三種聚合酶中是共同的，剩下的其他的亞基是各種聚合酶所特有的。,真核生物RNA聚合酶的活性,不需要引物，與細(xì)菌聚合酶不同的是與DNA結(jié)合時(shí)需要輔助因子,RNA聚合酶II的CTD,The largest subunit in RNA polymerase II has a CTD (carboxy-terminal domain) consisting of multiple repeats of a septamer（七聚體）. 羧基末端結(jié)構(gòu)域,Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser Repeat 52 times in the mouse enzyme and 26 times in yeast,重要的磷酸化現(xiàn)象： ser，tyr 磷酸化發(fā)生在酶離開啟動(dòng)子的延伸過程,CTD 尾可與 mRNA加工因子發(fā)生相互作用，而對(duì)mRNA的加工過程產(chǎn)生直接或間接的影響。所以CTD 尾在mRNA轉(zhuǎn)錄和加工的偶聯(lián)過程中發(fā)揮了重要作用。,RNA聚合酶I基因：核糖體重復(fù),核糖體RNA基因（成5簇，重復(fù)40） 前rRNA轉(zhuǎn)錄單元合有編碼18S、58S和28S rRNA的三段序列，在基因組中成簇排列，中間被非轉(zhuǎn)錄的間隔序列分開。,每一rRNA基因產(chǎn)生一個(gè)45S的rRNA轉(zhuǎn)錄物，隨后被切成28S 、18St)和5.8SrRNA各一個(gè)。這種RNA多基因拷貝的連續(xù)轉(zhuǎn)錄是產(chǎn)生足夠量且加工的rRNA、進(jìn)而包裝進(jìn)核糖體所必需。,核仁的作用 前rRNA由RNA聚合酶I在核仁中合成。rRNA基因排列成環(huán)一起組成核仁，也就是熟知的核組織區(qū)域。,RNA聚合酶I啟動(dòng)子 前rRNA啟動(dòng)子由兩個(gè)轉(zhuǎn)錄控制區(qū)域組成。核心元件和上游調(diào)控元件(UCE,核心元件包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，跨越31到6區(qū)域。這一序列為轉(zhuǎn)錄所必需的。 另一大約50一80個(gè)堿基區(qū)域稱作上游控制元件(UCE)，從起始上游大約100bp處(100)起始。 與核心元件單獨(dú)作用相比，UCE的存在使轉(zhuǎn)錄效率提高了10100倍。,上游結(jié)合因子（UBF）與UCE結(jié)合，也同時(shí)結(jié)合到核心元件上游的不同于UCE的位點(diǎn)上，是的兩位點(diǎn)間的DNA形成環(huán)狀結(jié)構(gòu) UBF缺乏時(shí)為低水平轉(zhuǎn)錄，存在時(shí)轉(zhuǎn)錄速率增強(qiáng),選擇因子（SL1）與UBF-DNA復(fù)合物結(jié)合并使其穩(wěn)定，然后RNA聚合酶I結(jié)合，起始轉(zhuǎn)錄 SL1四亞基組成，包括TATA結(jié)合蛋白（TBP，為所有RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄起始所需）和RNA聚合酶I特異的TBP相關(guān)因子（TAF）,RNA聚合酶III基因：5S與tRNA基因的轉(zhuǎn)錄,RNA聚合酶III 核質(zhì)中，由16或更多亞基構(gòu)成，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄5S rRNA的前體，tRNA，其他snRNA和胞質(zhì)RNA tRNA基因 轉(zhuǎn)錄控制區(qū)位于轉(zhuǎn)錄單元內(nèi)的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)之后。 有兩個(gè)高度保守的序列，即A框(5TGGCNNAGTGG3 ) 和B框(5 GGTTCGANNCC3)。 該序列同時(shí)也是編碼tRNA自身的重要序列，即編碼tRNA的D環(huán)和TvC環(huán)。tRNA內(nèi)的高度保守序列同時(shí)也是高度保守的啟動(dòng)子DNA 序列。,TFIIIC與啟動(dòng)子結(jié)合； TFIIIB與TFIIIC-DNA復(fù)合體結(jié)合； IFIIIB含三個(gè)亞基：TBP，BRF和B,負(fù)責(zé)募集RNA PolIII，起始轉(zhuǎn)錄,5S rRNA基因 基因串聯(lián)成簇， 啟動(dòng)子含有2個(gè)保守框：C框位于起始位點(diǎn)下游81-99個(gè)堿基處；A框位于起始位點(diǎn)下游50-65個(gè)bp TFIIIA結(jié)合在啟動(dòng)子C框后，TIIIC與TFIIIA-DNA復(fù)合體結(jié)合，并與A框結(jié)合， TFIIIB結(jié)合進(jìn)來募集聚合酶，起始轉(zhuǎn)錄。,可變的RNA聚合酶III啟動(dòng)子，可被上下游序列調(diào)控 RNA聚合酶III的終止 在無輔助因子參與下終止，一串A足以終止轉(zhuǎn)錄,RNA聚合酶II基因：啟動(dòng)子與增強(qiáng)子,RNA聚合酶II 催化所有編碼基因的mRNA前體的合成。RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄的前mRNA須經(jīng)過加帽、加尾和剪接等加工過程,順式作用元件 定義：影響自身基因表達(dá)活性的非編碼DNA序列。 例： 啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、沉默子等,真核生物啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu),核心啟動(dòng)子（core promoter） 上游啟動(dòng)子元件（upstream promoter element，UPE）,（1）啟動(dòng)子：在DNA分子中，RNA聚合酶能夠識(shí)別、結(jié)合并導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄起始的序列。,1、核心啟動(dòng)子 許多RNA聚合酶II啟動(dòng)子都含有一個(gè)稱做TATA框的序列，該序列位于起始位點(diǎn)上游2530bp處。其他的基因含有一個(gè)與起始位點(diǎn)重疊的起始元件，這些元件為基本轉(zhuǎn)錄復(fù)合體形成和轉(zhuǎn)錄起始所需。,定義：指保證RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄正常起始所必需的、最少的DNA序列，包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游TATA區(qū),作用：選擇正確的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，保證精確起始,TATA 常在-25bp左右，相當(dāng)于原核的-10序列 T85A97T93A85A63A83A50,2、上游啟動(dòng)子元件 啟動(dòng)子上游100200bp內(nèi)的元件通常是有效轉(zhuǎn)錄所需的，例如SPl和CCAAT框。,包括CAAT盒（CCAAT）和GC盒（GGGCGG）等,作用：控制轉(zhuǎn)錄起始頻率。,CAAT：-70 - -80bp GGGCGG：-80 - -110bp,（2）增強(qiáng)子：指能使與它連鎖的基因轉(zhuǎn)錄頻率明顯增加的DNA序列。,增強(qiáng)子指能從啟動(dòng)子的上游或下游數(shù)干個(gè)bp處來激活轉(zhuǎn)錄的序列元件稱為增強(qiáng)子。,增強(qiáng)子特點(diǎn)：, 增強(qiáng)效應(yīng)十分明顯，一般能使基因轉(zhuǎn)錄頻率增加10-200倍, 增強(qiáng)效應(yīng)與其位置和取向無關(guān)，不論增強(qiáng)子以什么方向排列（53或35），甚至和靶基因相距3 kb，或在靶基因下游，均表現(xiàn)出增強(qiáng)效應(yīng)；,An enhancer can activate a promoter from upstream or downstream locations, and its sequence can be inverted relative to the promoter,大多為重復(fù)序列，一般長約50bp，適合與某些蛋白因子結(jié)合。其內(nèi)部常含有一個(gè)核心序列：（G）TGGA/TA/TA/T（G），該序列是產(chǎn)生增強(qiáng)效應(yīng)時(shí)所必需的；, 增強(qiáng)效應(yīng)有嚴(yán)密的組織和細(xì)胞特異性，并擁有多種基序。從極長的增強(qiáng)子元件到較短的啟動(dòng)子元件，其內(nèi)均存在一系列連續(xù)的調(diào)控元件。, 沒有基因?qū)Ｒ恍?，可以在不同的基因組合上表現(xiàn)增強(qiáng)效應(yīng)；, 許多增強(qiáng)子還受外部信號(hào)的調(diào)控， 如金屬硫蛋白的基因啟動(dòng)區(qū)上游所帶的增強(qiáng)子，就可以對(duì)環(huán)境中的鋅、鎘濃度做出反應(yīng)。,增強(qiáng)子作用機(jī)理：,（3）沉默子：某些基因含有負(fù)性調(diào)節(jié)元件沉默子，當(dāng)其結(jié)合特異蛋白因子時(shí)，對(duì)基因轉(zhuǎn)錄起阻遏作用。,啟動(dòng)子對(duì)轉(zhuǎn)錄的影響,原核基因啟動(dòng)區(qū)范圍較小 TATAAT中心位于710；上游3070區(qū)為正調(diào)控因子結(jié)合序列；120為負(fù)調(diào)控因子結(jié)合序列 真核基因的調(diào)控區(qū)較大 TATAA/TA區(qū)位于-2030;40-110為上游激活區(qū)。 原核基因啟動(dòng)子上游只有TTGACA區(qū)（3040） 真核基因除了含有可與之相對(duì)應(yīng)的CAAT區(qū)之外，許多還有GC區(qū)和增強(qiáng)子區(qū),通用轉(zhuǎn)錄因子與RNA聚合酶II的起始,RNA聚合酶II的基本轉(zhuǎn)錄因子 具有與RNA聚合酶啟動(dòng)子結(jié)合并一起起始轉(zhuǎn)錄的特征。 以特定順序在基本啟動(dòng)子組裝，受不同水平調(diào)控,TFIID 與TATA框結(jié)合，由TATA結(jié)合蛋白（TBP）與TBP相關(guān)因子或多輔助因子構(gòu)成 TBP 有一個(gè)可與TATA的DNA小溝結(jié)合的馬鞍型結(jié)構(gòu)，可使DNA解旋并引入45o的彎曲，所有RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄起始所需 TFIIA 可增強(qiáng)TFIID與TATA框的結(jié)合，似乎可以終止抑制因子與TFIID的結(jié)合 TFIIB 與IFIID結(jié)合，為RNA聚合酶和TFIIF加入復(fù)合體起橋梁作用 RNA聚合酶進(jìn)入之后的結(jié)合因子 TFIIE，TFIIH和TFIIJ，其中TFIIH可使RNA聚合酶II的羧基末端結(jié)構(gòu)域磷酸化，導(dǎo)致復(fù)合體形成。,轉(zhuǎn)錄因子 TFIID 轉(zhuǎn)錄復(fù)合體 TBP TAFs TFIIA TFIIB TFIIF Pol II TFIIE RNA pol 的轉(zhuǎn)錄起始, 真核生物轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物,轉(zhuǎn)錄后加工,5端加帽 3端加尾 RNA的剪接 RNA的編輯,真核基因結(jié)構(gòu),第二節(jié) 真核生物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,反式作用因子,定義：能直接或間接地識(shí)別或結(jié)合在各類順式作用元件核心序列上，參與調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄效率的蛋白質(zhì)。,TFD（TATA）、CTF（CAAT）、SP1（GGGCGG）、HSF（熱激蛋白啟動(dòng)區(qū)）,真核生物的轉(zhuǎn)錄因子 與通用轉(zhuǎn)錄因子不同，通過與特定啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)如增強(qiáng)子的親和發(fā)現(xiàn)，先于特定DNA結(jié)合，然后激活轉(zhuǎn)錄。,轉(zhuǎn)錄因子的類型,1）基本轉(zhuǎn)錄因子(Basal factor): 和RNA聚合酶一起結(jié)合于起始點(diǎn)和TATA盒； 2）激活劑(activator)： 特異性識(shí)別短共有序列元件的轉(zhuǎn)錄因子。它們結(jié)合于啟動(dòng)子或增強(qiáng)子位點(diǎn)上。通過增加基本轉(zhuǎn)錄復(fù)合體(basal apparatus)結(jié)合于啟動(dòng)子的效率而起作用； 3）輔激活劑(coactivator): 連接了激活劑和基本轉(zhuǎn)錄復(fù)合體； 4）一些調(diào)節(jié)因子(Some regulators)： 可使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變。,2、結(jié)構(gòu),DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域,結(jié)構(gòu)域,連接區(qū),一些轉(zhuǎn)錄因子還含有二聚體結(jié)構(gòu)域,（1）DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域：,螺旋-轉(zhuǎn)折-螺旋（Helix-turn-helix，H-T-H） 鋅指結(jié)構(gòu)（zinc finger） 堿性-亮氨酸拉鏈（basic - leucine zipper） 堿性-螺旋-環(huán)-螺旋（basic helix /loop /helix，bHLH）,同源域是一個(gè)DNA結(jié)合域，它由60個(gè)氨基酸組成，并形成3個(gè)螺旋。C端的螺旋有17個(gè)氨基酸，它結(jié)合DNA大溝。同源域N端臂插入DNA小溝。 含同源域的蛋白質(zhì)可能是轉(zhuǎn)錄的激活劑或阻抑物。,1、螺旋-轉(zhuǎn)折-螺旋（helix-turn-helix）,現(xiàn)廣泛分布在從酵母到人類的各種真核生物中，雖彼此在氨基酸的順序上差別很大，但高級(jí)結(jié)構(gòu)高度保守。,Helix 3 of the homeodomain binds in the major groove of DNA, with helices 1 and 2 lying outside the double helix. The N-terminal arm lies in the minor groove, and makes additional contacts.,2、鋅指結(jié)構(gòu),配位鍵,2-9個(gè),定義：是一種常出現(xiàn)在DNA結(jié)合蛋白中的結(jié)構(gòu)基元。是由一個(gè)含有大約30個(gè)氨基酸的環(huán)和一個(gè)與環(huán)上的4個(gè)Cys或2個(gè)Cys和2個(gè)His配位的Zn構(gòu)成，形成的結(jié)構(gòu)像手指狀。,“鋅指”是根據(jù)其結(jié)構(gòu)命名的，其中一小段保守氨基酸與Zn2+結(jié)合，形成一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的區(qū)域。有兩類DNA結(jié)合蛋白含有這種結(jié)構(gòu)： 1）經(jīng)典的“鋅指”蛋白質(zhì) 2）類因醇受體,1）經(jīng)典的“鋅指”蛋白質(zhì),典型“鋅指蛋白”含有一連串鋅指。 單個(gè)鋅指共有序列如下圖所示： Cys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2- His-X3-His 稱為Cys2/His2鋅指。,轉(zhuǎn)錄因子SP1 （GC盒） 、連續(xù)的3個(gè)鋅指重復(fù)結(jié)構(gòu)。,謹(jǐn)慎理解鋅指存在的意義： 尤其是蛋白質(zhì)僅含有單個(gè)鋅指時(shí)，鋅指可能參與RNA的結(jié)合而不是DNA結(jié)合，或它與任何核酸結(jié)合活性均無關(guān)。,2）類固醇受體,類固醇受體（ Steroid receptors）是配體應(yīng)答的激活劑,它通過結(jié)合類固醇（或其他相關(guān)分子）而激活。它們有獨(dú)立的DNA結(jié)合域和配體結(jié)合域。 類固醇受體的DNA結(jié)合域是一類鋅指： Cys-X2-Cys-X13-Cys-X2-Cys 被稱為Cys2/ Cys2鋅指。 如糖皮質(zhì)激素受體和雌激素受體各含兩個(gè)鋅指。,配體的結(jié)合使得受體（如類固醇受體）能夠結(jié)合應(yīng)答元件： 配體結(jié)合于受體的C端結(jié)構(gòu)域，提高了DNA結(jié)合域?qū)NA特異靶位點(diǎn)的親和力。,3、堿性-亮氨酸拉鏈,二聚體結(jié)構(gòu)域 亮氨酸之間相互作用形成二聚體，形成“拉鏈” 。 肽鏈氨基端2030個(gè)富含堿性氨基酸結(jié)構(gòu)域與DNA結(jié)合。,這類蛋白質(zhì)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)嶋H是以堿性區(qū)和亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域整體作為基礎(chǔ)的。,這種基序含有4-8個(gè)亮氨酸，每兩個(gè)亮氨酸由6個(gè)氨基酸間隔。,4、堿性-螺旋-環(huán)-螺旋,DNA結(jié)合蛋白有兩個(gè)共同特征，即存在結(jié)合DNA的螺旋區(qū)和形成蛋白質(zhì)二聚體的能力。螺旋-環(huán)-螺旋蛋白同時(shí)具有這兩特征。,除個(gè)別情況外，大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子一旦同DNA結(jié)合，便會(huì)通過其他因子或RNA聚合酶之間的相互作用，激發(fā)靶基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。這是因轉(zhuǎn)錄因子中存在著一種特殊的功能結(jié)構(gòu)域，即常說的轉(zhuǎn)錄激活域(Transcriptional activation domain),(2) 反式作用因子中的轉(zhuǎn)錄激活域,1酸性激活域,它們之間并不存在較為明顯的氨基酸序列的同源性，但卻都含有高比例的酸性氨基酸，產(chǎn)生出很強(qiáng)的凈負(fù)電荷。 例：糖皮質(zhì)激素受體蛋白質(zhì)17/82；GCN4為17/60,2 富含谷氨酰胺的激活域 glutamine-rich activation domain,例：在組成型表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子SP1的兩個(gè)最強(qiáng)的激活域中，谷氨酰胺幾乎占了25%，而帶負(fù)電菏的氨基酸比例則非常低。,3 富含脯氨酸的激活域 proline-rich activation domain,與CCAAT元件結(jié)合的組成型轉(zhuǎn)錄因子CTF/NF1，轉(zhuǎn)錄激活域位于轉(zhuǎn)錄因子的C-末端，含有大量的脯氨酸，約占該區(qū)域的1/4。,結(jié)構(gòu)域阻抑物,通過掩蓋DNA結(jié)合區(qū)域或降低轉(zhuǎn)錄活性來間接阻斷轉(zhuǎn)錄因子的活動(dòng)， 或者本身就含有一個(gè)特定的直接阻抑的結(jié)構(gòu)域,轉(zhuǎn)錄調(diào)控舉例1,組成性轉(zhuǎn)錄因子：SP1 含有3個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)和2個(gè)富含谷氨酰胺轉(zhuǎn)錄激活域。,激素調(diào)控：類固醇激素受體,轉(zhuǎn)錄調(diào)控舉例2,磷酸化調(diào)控：STAT蛋白 干擾素激活JAK激酶，促使STAT 1發(fā)生磷酸化， STAT 1二聚化后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，激活目標(biāo)蛋白表達(dá),轉(zhuǎn)錄調(diào)控舉例3,第三節(jié) RNA加工與核糖核蛋白復(fù)合體,RNA processing and RNPs 發(fā)生在轉(zhuǎn)錄過程中和轉(zhuǎn)錄后，新合成的RNA分子在結(jié)構(gòu)和化學(xué)方面的成熟。,細(xì)胞內(nèi)主要含有的RNA： 核糖體RNA (ribosomal RNA, rRNA); 轉(zhuǎn)移RNA (transfer RNA, tRNA) 信使RNA (messenger RNA, mRNA) 核內(nèi)不均一RNA (heterogeneous nuclear RNA, hnRNA) 真核細(xì)胞前體mRNA 核小RNA ( small nuclear RNA, snRNA) 原核生物沒有后兩種RNA scRNA, small cytoplasmic RNA, 胞內(nèi)小RNA: several molecules present in the cytoplasm and (sometimes) nucleus,Function of RNA,RNA常見的加工類型： 1 The removal of nucleotides 2 The addition of nucleotides 3 The modification of certain nucleotides,Deletion: 5-leader, 3-tail, intron Addition: 5-cap, 3-poly(A), editing Modification: methylation,rRNA加工與核糖體,rRNA加工與核糖體 rRNA processing and ribosomes RNA加工是對(duì)初生轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行修飾的總稱,原核生物的rRNA加工,大腸桿菌中，rRNA操縱子分散在基因組中，每一操縱子均包含有5S rRNA，16S rRNA，23S rRNA序列各一個(gè)，還包含一到四個(gè)tRNA的編碼序列。 初生轉(zhuǎn)錄物的沉降系數(shù)為30S，存在時(shí)間很短，經(jīng)過加工生成rRNA和tRNA分子。RNase酶III、M5、M16和M23等參與了rRNA的加工過程。,轉(zhuǎn)錄物通過內(nèi)部互補(bǔ)序列間的堿基配對(duì)折疊形成一些莖環(huán)結(jié)構(gòu)，并結(jié)合蛋白質(zhì)稱之為核糖核蛋白復(fù)合體（RNA-protein complexes，RNPs）。 結(jié)合后即開始并完成剪切及修飾，釋放出成熟的RNA分子。,真核生物rRNA的加工,真核生物中rRNA100轉(zhuǎn)錄單位，由RNA聚合酶I轉(zhuǎn)錄生成一個(gè)長的單鏈前體分子包含含有18S、5.8S、28S（后兩個(gè)構(gòu)成23S）編碼區(qū)域的拷貝各一個(gè)。5S rRNA由RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄，幾乎不需要加工。 特定剪切-特異性核糖甲基化（小核糖核蛋白微粒snRNP完成）-折疊-與核糖體復(fù)合。 折疊、復(fù)合和轉(zhuǎn)錄同時(shí)在核內(nèi)進(jìn)行,Ribosome核糖體,A supramolecular complex of rRNAs and proteins, the site of protein synthesis Have two subunit,真核生物的核糖體,tRNA的加工、RNA酶P和核酶,原核生物的tRNA加工. 大腸桿菌rRNA操縱子包括了tRNA的編碼基因區(qū)域,此外Ecoli還含有其他多至7種tRNA的基因操縱子, tRNA基因被間隔序列相隔. 成熟的tRNA分子從這些操縱子前體轉(zhuǎn)錄物加工.,1.前體轉(zhuǎn)錄物折疊形成莖環(huán)結(jié)構(gòu). 2.內(nèi)切RNase E,F,在3/端切除一個(gè)側(cè)翼序列,留下額外的核苷酸. 3.外切RNase D切去3/端7個(gè)核苷酸. 4.內(nèi)切RNaseP內(nèi)切產(chǎn)生成熟的t.RNA5/端. 5.內(nèi)切RNaseD切去3/端2個(gè)核苷酸., 3/端成熟. 6.tRNA系列鹼基修飾.,真核生物tRNA的加工,特點(diǎn): 5/端帶有16 nt的前導(dǎo)區(qū)，3/端2個(gè)nt及14 nt內(nèi)合子,1) t.RNA前體形成莖環(huán)結(jié)構(gòu).；2)內(nèi)切酶的識(shí)別切除5/端16 nt和3/端2nt. 3) t.RNA核苷轉(zhuǎn)移酶,在3/端加上, 5/-CCA-3/結(jié)構(gòu).；4)切除內(nèi)合子再連接.,真核和原核生物均有發(fā)現(xiàn)，為含有一個(gè)RNA分子+一個(gè)蛋白分子的內(nèi)切酶，是簡單RNP。 作用:修剪前t.RNA分子,產(chǎn)生成熟5/端。 意義：這種RNA是具有催化作用的RNA，稱為核酶，即使無蛋白質(zhì)存在也可催化反應(yīng)。,核糖核酸酶P和核酶,RnaseP,核酶: 可催化特定反應(yīng)的RNA分子。細(xì)胞內(nèi)蛋白有助于催化，鎂離子可提高活性 RNaseP內(nèi)切核酸酶；內(nèi)含子的自我剪接 利用人工設(shè)計(jì)核酶可體內(nèi)剪切mRNA分子抑制轉(zhuǎn)錄表達(dá)，組織病毒復(fù)制、殺死癌細(xì)胞及基因失活.,mRNA加工:,原核生物m RNA 很少需要加工，m RNA分子邊合成邊翻譯,從5/端開始降解.3/端和5/端可形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)形成對(duì)外切酶的屏障，.在完全降解前,可增加翻譯頻率 真核生物 mRNA RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄，前體為核內(nèi)不均一hnRNA, 加工包括四個(gè)方面： 5/端加帽；3/端剪切和加polyA尾； 剪接；甲基化,mRNA加工hnRNP和SnRNP,hnRNP,RNA聚合酶合成的hnRNA很快被蛋白包圍,形成核內(nèi)不均一RNP。 功能 保持hnRNA單鏈狀態(tài)，并輔助各種RNA加工反應(yīng).,snRNP 顆粒,參與前mRNA的剪接和rRNA 甲基化位點(diǎn)的確定,5端加帽,5端的一個(gè)核苷酸總是7-甲基鳥核苷三磷酸（m7Gppp）。mRNA5端的這種結(jié)構(gòu)稱為帽子（cap）。,在轉(zhuǎn)錄進(jìn)行至2030nt之前，5端強(qiáng)化系修飾，加上一個(gè)7-甲基鳥苷殘基，稱為帽狀結(jié)構(gòu)。 通過一個(gè)GMP核苷酸的反方向加到新生的RNA轉(zhuǎn)錄物上，形成5-5三磷酸橋。由mRNA鳥苷轉(zhuǎn)移酶催化,帽子結(jié)構(gòu)功能： 能被核糖體小亞基識(shí)別，促使mRNA和核糖體的結(jié)合； m7Gppp結(jié)構(gòu)能有效地封閉mRNA 5末端，以保護(hù)mRNA免受5核酸外切酶的降解，增強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定。,3端加尾,多聚腺苷酸尾巴,AAUAAA： 準(zhǔn)確切割 加poly（A）,需要DNA和mRNA前體上的特定序列 5-AAUAAA-3 聚腺苷酸化信號(hào)序列，其后 11-20nt處緊隨一個(gè)，5-YA-3結(jié)構(gòu)，Y為嘧啶,下游富含G、U序列-聚腺苷酸化位點(diǎn) 需要聚腺苷酸聚合酶加尾 蛋白因子識(shí)別上述序列，組裝復(fù)合體開始剪切,多聚腺苷酸尾巴功能： 提高了mRNA在細(xì)胞質(zhì)中的穩(wěn)定性。Poly A結(jié)合蛋白結(jié)合抵抗3外切酶攻擊 有助于細(xì)胞之中成熟RNA的翻譯,剪接,地中海貧血病人的珠蛋白基因，1/4,切除內(nèi)含子將外含子連接在一起的過程，發(fā)生在核內(nèi)，mRNA成熟后轉(zhuǎn)錄到胞質(zhì),剪切識(shí)別序列 內(nèi)含子的5端5-GU-3；3端5-AG-3序列 AG前有一段富含嘧啶的嘧啶區(qū) 脊椎動(dòng)物在嘧啶區(qū)上游1040nt處稱為分支點(diǎn)序列 5-CURAY-3 也稱5-剪切位點(diǎn),mRNA splicing: Two-step,First, the bond in front of the G at the 5-end of the intron at the so-called 5-splice site is attacked by the 2-hydroxyl group of the A residue of the branchpoint sequence to creat a tailed circular molecule called a lariat and free exon 1. in the second step, cleavage at 3-splice site occurs after the G of the AG, as the two exon sequences are joined togather. The intron is released in the lariat from and is eventually degraded.,mRNA splicing is accomplished through small RNAs (U1, U2, U4, U5 and U6) and associated proteins (snRNPs) which form a complex called the splicesome. First, U1 binds to the 5-splice site and the U2 binds to the branchpoint. The tri-snRNP compex of U4, U5 and U6 can the bind, and in so doing the intron is looped out and the 5- and 3exons are brought into close proximity.,mRNA splicing:snRNP,Molecular Biology,5AGGUAAGU .CURAY(10-40)(U/C)11NCAG G.3,Intron,exon,exon,多聚嘧啶,AG前一位核苷酸影響剪接效率，存在剪接競(jìng)爭 CAG = UAG AAG GAG,生物體內(nèi)內(nèi)含子的主要類型： GU-AG、AU-AC、類內(nèi)含子、類內(nèi)含子,可變mRNA加工,可變加工 可將mRNA前體轉(zhuǎn)化為一種以上的成熟mRNA。實(shí)現(xiàn)方式： 1可變剪接-特定外顯子被剪掉 2可變poly（A）加工-選擇不同的poly A位點(diǎn)，產(chǎn)生不同3端的成熟mRNA,可變poly A加工 可變poly (A) 位點(diǎn)： 一些前mRNA含有多于一組的可剪切及加尾序列相同編碼區(qū)，不同穩(wěn)定性，或定位的成熟mRNA可在同一細(xì)胞中，兩個(gè)位點(diǎn)，加工并存，也可能一種細(xì)胞只利用一種poly A位點(diǎn)，有時(shí)可導(dǎo)致采用不同的剪切方式。,2019/7/9,88,可變poly(A) 加工,可變剪切：,四種方式 （1）利用不同的啟動(dòng)子 （2）利用不同的polyA位點(diǎn)使用不同外顯子保留的不同 （3）保留內(nèi)含子，其中含有終止密碼子截?cái)嗟摹⑹Щ畹?（4）外顯子的保留或切除，差異，剪切,Patterns of Alternative Splicing,(A) A cassette exon is defined as a regulated exon that is either included in the mRNA or excluded. (B) Alternat