PTSD 大鼠杏仁核神經(jīng)元凋亡相關(guān)基因 Bax、Bcl-2.doc

ptsd 大鼠杏仁核神經(jīng)元凋亡相關(guān)基因 bax、bcl-2的表達(dá)及與細(xì)胞凋亡的關(guān)系1丁金蘭，韓芳，石玉秀* 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，沈陽(yáng)（110001） e-mail：摘要：觀察創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(ptsd)大鼠杏仁核神經(jīng)元細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)與細(xì)胞凋 亡，從杏仁核神經(jīng)元細(xì)胞凋亡揭示ptsd的部分發(fā)病機(jī)制。成年健康雄性wister大鼠50只，隨 機(jī)分為sps模型的1d、4d、7d、14d組及正常對(duì)照組。應(yīng)用免疫組化和western blotting技術(shù)檢 測(cè)凋亡相關(guān)基因bax、bcl-2在ptsd杏仁核神經(jīng)元的表達(dá)；采用 tunel法檢測(cè)ptsd大鼠杏仁 核神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。ptsd大鼠杏仁核神經(jīng)元凋亡相關(guān)基因bax/bcl-2于4天達(dá)高峰，之后漸趨 下降。tunel陽(yáng)性細(xì)胞在sps各組模型均出現(xiàn)，4天達(dá)最高峰。ptsd大鼠杏仁核神經(jīng)元細(xì)胞 凋亡中，凋亡相關(guān)基因bax、bcl-2各自發(fā)揮促進(jìn)凋亡和抑制凋亡的作用，bax/bcl-2比值升高 促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡，可能與杏仁核調(diào)節(jié)的ptsd恐懼異常的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。 關(guān)鍵詞：ptsd；杏仁核；凋亡；bcl-2；bax中圖分類號(hào)： r32281文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： a1. 引言創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(posttraumatic stress disorder, ptsd)是指由異常威脅性或?yàn)?zāi)難性心理創(chuàng) 傷導(dǎo)致延遲出現(xiàn)和長(zhǎng)期持續(xù)的精神障礙1。在嚴(yán)重創(chuàng)傷應(yīng)激急性期，邊緣系統(tǒng)為應(yīng)激應(yīng)答敏 感區(qū),其功能和應(yīng)激聯(lián)系密切，杏仁核是邊緣系統(tǒng)中重要的皮質(zhì)下核團(tuán)，因此在 ptsd 的發(fā) 病中起重要作用。目前的 ptsd 研究已表明，mri 檢測(cè)報(bào)道海馬萎縮2，由于海馬神經(jīng)元凋 亡，致體積減小3, 4。杏仁核和海馬的功能密切相關(guān)，海馬的功能受杏仁核的調(diào)節(jié)而實(shí)現(xiàn)5， 有研究報(bào)道 ptsd 杏仁核體積變小,杏仁核的活動(dòng)量與癥狀的嚴(yán)重程度成正相關(guān)6, 7，那么 ptsd 杏仁核體積變小是否由神經(jīng)元凋亡所導(dǎo)致呢？近年的研究顯示，凋亡相關(guān)基因 bax 和 bcl-2 在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。bax 和 bcl-2 被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡調(diào)控的最后 通路之一，并且二者比值增大時(shí),細(xì)胞趨于凋亡8，因此把兩者作為杏仁核神經(jīng)元細(xì)胞凋亡中 的一對(duì)基因共同研究顯得尤為重要。本研究通過(guò)國(guó)際上公認(rèn)的 sps 模型，采用免疫組化、 western blotting 和 tunel 染色方法對(duì)大鼠杏仁核神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行了檢測(cè)，旨在為研究 ptsd 杏仁核神經(jīng)元細(xì)胞的形態(tài)、功能及部分發(fā)病機(jī)制提供豐富的理論和形態(tài)學(xué)證據(jù)。2. 材料和方法2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組成年健康雄性wistar大鼠50只，體重150180g，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，隨 機(jī)分為5組，即sps的1d、4d、7d、14d組及正常對(duì)照組,每組10只。2.2 動(dòng)物模型的建立和取材采用日本文部省召開(kāi)的“基礎(chǔ)和臨床的研究進(jìn)展”的會(huì)議確定的關(guān)于 ptsd 模型sps 刺1本課題得到國(guó)家自然科學(xué)基金（項(xiàng)目編號(hào) 30600341）的資助。*通信聯(lián)系人。- 7 -激。sps 刺激是指將大鼠連續(xù)進(jìn)行下述步驟處理，即：大鼠禁錮 2 小時(shí)后，立即強(qiáng)迫游泳20min（水深 40cm，水溫 25）。經(jīng)過(guò) 15min 的恢復(fù)，乙醚麻醉至意識(shí)喪失，在籠子中不再 經(jīng)任何刺激正常飼養(yǎng)至取材。分別取 sps 1d、4d、7d、l4d 及正常對(duì)照組大鼠進(jìn)行灌流固定。大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉腹腔 注射麻醉后，用 0.01mpbs 緩沖配置的 4多聚甲醛心臟灌流，取出腦組織，并浸入同種固定液中續(xù)固定 3h，常規(guī)石蠟包埋，切 5m 厚的冠狀切片。2.3 免疫組化（pv法）進(jìn)行bax、bcl-2染色與圖像分析切片脫蠟后，將切片入枸櫞酸鹽緩沖液中抗原熱修復(fù)，滴加兔抗鼠bax抗體(購(gòu)于santa cruz biotechnology公司，工作濃度為1：50），4過(guò)夜，滴加igg抗體-hrp多聚體（pv試 劑盒購(gòu)于zsgb-bio公司）37 30min，dab顯色，蘇木素染核，常規(guī)脫水，透明，中性樹 膠封片。光學(xué)顯微鏡(olympus，bx60，japan)下觀察，攝片。bcl-2為羊抗兔一抗抗體(購(gòu) 于santa cruz biotechnology公司，工作濃度為1：50），其余步驟同bax。應(yīng)用metamorph/dpio/bx41形態(tài)學(xué)圖象分析系統(tǒng)軟件，對(duì)上述免疫組化染色切片進(jìn)行了半定量 分析。在高倍（1040倍）視野下，每張免疫組化染色切片取 5 個(gè)視野，記錄每個(gè)視野內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞 光密度值，取平均光密度。每組大鼠共選取 5 張切片，然后求相應(yīng)組的bax與bcl-2的比值，具 體半定量分析結(jié)果。2.4 western blotting檢測(cè)凋亡基因bax、bcl-2的表達(dá)取新鮮杏仁核組織經(jīng)勻漿、超聲粉碎后高速低溫離心，11000rmpmin，取上清；采用 考馬斯亮藍(lán)法定蛋白濃度為3mgml；每例標(biāo)本提取蛋白5og，10%sdspage變性凝膠 電泳，濃縮膠90v、30 min和分離膠110v、 120 min；恒壓轉(zhuǎn)移到pvdf膜上，4過(guò)夜，5% 脫脂奶粉封閉60min；兔抗鼠bax、bcl-2一抗(工作濃度1：500)中孵育4過(guò)夜；igg抗體-hrp 多聚體(工作濃度1：5000)孵育2h，定影，顯影，圖像分析。應(yīng)用image j分析軟件分析上述結(jié)果,目的條帶bax、bcl-2 的平均灰度值分別表示bax、bcl-2蛋白水平（灰度值越大，蛋白表達(dá)越少）,求各條帶的平均灰度值的比值。2.5 tunel 染色采用tunel法原位標(biāo)記dna片段檢測(cè)凋亡細(xì)胞，原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(由roch公司 提供) ,組織切片常規(guī)脫蠟至水，0.3%過(guò)氧化氫封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，蛋白酶k消化, tdt反應(yīng)液、anti-fluorescein antibody 工作液37 各作用1 h, dab顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī) 脫水，透明，中性樹膠封片。不含tdt反應(yīng)液的為陰性對(duì)照。每張玻片分別隨機(jī)取5個(gè)高倍鏡視野，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算凋亡指數(shù)，凋 亡指數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)100。2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所得數(shù)據(jù)使用spss13.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用平均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示。應(yīng)用單因素方差分 析， p0.05 判為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3. 結(jié)果3.1 大鼠杏仁核bax, bcl-2的免疫組化染色結(jié)果免疫組化染色陽(yáng)性信號(hào)為棕黃色，陽(yáng)性表達(dá)的bax 和bcl-2 染色定位于細(xì)胞漿（圖1，2）。bax免疫組化結(jié)果顯示，在正常組大鼠杏仁核中極少量bax陽(yáng)性信號(hào)，而在sps1天，杏 仁核中 bax表達(dá)明顯增多；bax的這種高表達(dá)在sps4天達(dá)到高峰，而在7天，bax表達(dá)量下降，14天表達(dá)進(jìn)一步下降，明顯低于sps4天組，與正常對(duì)照組相似（圖1）。bax在sps后表達(dá)增 加，這是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的特征。bcl-2免疫組化結(jié)果顯示，在正常組大鼠杏仁核中bcl-2呈極弱陽(yáng)性反應(yīng)，而在sps1天時(shí)， 杏仁核中bcl-2表達(dá)較正常對(duì)照組大鼠明顯增高，sps4天、7天、14天，bcl-2表達(dá)量較1天組 漸趨下降（圖2）。bcl-2在正常大鼠杏仁核中幾乎沒(méi)有表達(dá)，但在sps后則出現(xiàn)表達(dá)，這是 機(jī)體對(duì)抗凋亡的一種反應(yīng)。圖1. 1a 正常對(duì)照組bax 免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞 400fig.1 1a immunoreaction of bax in rat amygdala of control group4001b sps 4天組bax免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞4001b immunoreaction of bax in rat amygdala of sps 4d4001c sps 14天組bax免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞4001c immunoreaction of bax in rat amygdala of sps 14d400圖2. 2a 正常對(duì)照組bcl-2免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞 400fig.2 2a immunoreaction of bcl-2 in rat amygdala of control group 4002b sps 4天組bcl-2免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞4002b immunoreaction of bcl-2 in rat amygdala of sps 4d4002c sps 14天組bcl-2免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞 4002c immunoreaction of bcl-2 in rat amygdala of sps 14d400對(duì)上述免疫組化染色切片在高倍視野下,記錄每個(gè)視野內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞吸光度值，取平均光 密度(od)。然后求相應(yīng)組的bax與bcl-2的比值，具體半定量分析結(jié)果見(jiàn)表1。表1 不同時(shí)間點(diǎn)大鼠杏仁核神經(jīng)元bax及bcl-2表達(dá)情況(od)（xs，n=10）table 1 the amygdala neurons bax and bcl-2 expression at different time(od) (xs)組別baxbcl-2bax/ bcl-2正常組 sps-1d組 sps-4d組 sps-7d組 sps-14d組23.25522.152681.89115.369487.34434.3659858.6422 3.215440.4356 2.983525.69353.269763.15256.436143.53194.865237.17154.198332.29833.51640.70510.32641.29670.4381*2.00640.6325*1.57760.3953*1.25190.2967*注：與正常組比較，*表示 p 0.05。由表中可知，bax/ bcl-2的比值在4天達(dá)高峰，7天和14天漸趨下降至正常。3.2 western blotting結(jié)果正常組條帶較淡,sps各組條帶明顯比正常組深，與正常組相比,蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（圖3）。 蛋白表達(dá)隨時(shí)間變化與免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞od值隨時(shí)間變化一致，見(jiàn)表2。表2 杏仁核bax 、bcl-2 western botting的平均灰度值（xs）table.2 the average gray value in amygdale of bax and bcl-2 western botting組別baxbcl-2bax/ bcl-2正常組 sps-1d組 sps-4d組 sps-7d組 sps-14d組189.691510.264571.70684.561265.11313.6294120.83316.8652141.63708.5497180.681413.152151.53617.2681161.05157.8249184.50628.9546198.94379.52751.0499 0.25840.47320.1537*0.40430.1263*0.65490.1948*0.71190.2161*注：與正常組比較，*表示 p 0.05。圖3 western blotting 檢測(cè)各組bax, bcl-2蛋白表達(dá)各條帶從左向右依次為正常對(duì)照組及sps的1、4、7、14d組fig3 the expression of bax, bcl-2 protein in different group (western blotting)3.3 tunel染色結(jié)果光鏡下見(jiàn)凋亡細(xì)胞深染為棕黃色,非凋亡細(xì)胞的核呈藍(lán)色。在未加tdt酶和標(biāo)志液的切 片未見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞；正常組可見(jiàn)少量tunel陽(yáng)性細(xì)胞。sps各組均可見(jiàn)散在的tunel陽(yáng)性細(xì) 胞，sps4天陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)達(dá)高峰,（p0.05）之后呈逐漸下降趨勢(shì)（圖4）。sps各組與正常組 及sps組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( p 0.05) (見(jiàn)表 3)圖4. 4a 原位末端標(biāo)記法（tunel）標(biāo)記正常對(duì)照組的凋亡細(xì)胞400fig.4 4a tunel detected the normal control group of apoptotic cells4004b sps4d 原位末端標(biāo)記法（tunel）標(biāo)記出大量凋亡細(xì)胞4004b many tunel-positive cells were detected 4d after sps4004c sps14d 原位末端標(biāo)記法（tunel）標(biāo)記出少量凋亡細(xì)胞4004c few tunel-positive cells were detected 14d after sps400表3. 大鼠杏仁核神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡指數(shù)table.3 apoptotic index（ai）of rat amygdale neurons組別鼠數(shù)凋亡指數(shù)（%）正常組 sps-1d組 sps-4d組 sps-7d組 sps-14d組101.19641.5146109.21963.2913*1015.69512.1785*1010.13853.9291*103.35842.2435*注：與正常組比較，*表示 p 0.054. 討論近年來(lái),由于戰(zhàn)爭(zhēng)、自然災(zāi)害、暴力事件等頻頻發(fā)生,創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙發(fā)病率越來(lái)越高， 造成腦內(nèi)各結(jié)構(gòu)功能失調(diào)，給人們的身心造成創(chuàng)傷。杏仁核是恐懼形成和表達(dá)的關(guān)鍵中樞， 作為大腦中一個(gè)關(guān)鍵的區(qū)域來(lái)調(diào)節(jié)這些消極應(yīng)激。杏仁核結(jié)構(gòu)的改變導(dǎo)致功能的異常，因此， 研究它的結(jié)構(gòu)從而研究它的發(fā)病機(jī)制越來(lái)越重要。從遭受腦損傷和情緒創(chuàng)傷性事件的越南老 兵身上我們發(fā)現(xiàn)大量這些個(gè)體中ptsd的出現(xiàn)損傷包括杏仁核的前顳部9。還有的研究發(fā)現(xiàn) 在ptsd時(shí)杏仁核體積減小，在應(yīng)激狀態(tài)下，杏仁核神經(jīng)元細(xì)胞可能發(fā)生了凋亡從而導(dǎo)致了 杏仁核的體積減小。本文從這一角度檢測(cè)了杏仁核神經(jīng)元細(xì)胞的形態(tài)改變。細(xì)胞凋亡(apoptosis)，又稱程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death)，是指細(xì)胞為維持內(nèi) 環(huán)境穩(wěn)定，由基因活動(dòng)指導(dǎo)下的主動(dòng)性死亡。目前已知凋亡過(guò)程中伴隨著一系列凋亡相關(guān)基 因的表達(dá)，其中bcl-2基因蛋白家族在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用，并被認(rèn)為是細(xì) 胞凋亡調(diào)控的最后通路之一。bcl-2表達(dá)水平較高時(shí),形成bcl-2/ bcl-2同源二聚體,抑制細(xì)胞凋亡，而 bax作為bcl-2的同源體，是bcl-2家族中最具有促進(jìn)凋亡特征的基因。bax被表達(dá)并轉(zhuǎn)位于線粒體是對(duì)各種細(xì)胞死亡信號(hào)的反應(yīng), bax能誘導(dǎo)各種蛋白分解, 抑制bcl-2的作用， 從而有促進(jìn)凋亡作用10，bax表達(dá)水平較高時(shí),形成bax/ bax同源二聚體,加速細(xì)胞凋亡11。 近年的研究提示bcl-2與bax調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡,不僅取決于自身表達(dá)的高低,還與bax/ bcl-2比值 有關(guān), bax/ bcl-2在中樞神經(jīng)細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用。bax / bcl-2比值決定了在創(chuàng)傷刺激下細(xì) 胞是否進(jìn)入凋亡12,13，當(dāng)比值增大時(shí),細(xì)胞趨于凋亡。因此,把兩者作為杏仁核神經(jīng)元細(xì)胞凋 亡中的一對(duì)基因共同研究顯得更為重要。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，bax/ bcl-2比值在sps后明顯上調(diào)， 提示凋亡相關(guān)基因bax和bcl-2調(diào)控ptsd杏仁核神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡。ptsd大鼠杏仁核神經(jīng)元細(xì)胞凋亡中，凋亡相關(guān)基因bax、bcl-2各自發(fā)揮促進(jìn)凋亡和抑 制凋亡的作用，bax/bcl-2比值升高促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡，可能與杏仁核調(diào)節(jié)的ptsd恐懼異常 的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)tunel染色測(cè)定凋亡指數(shù)發(fā)現(xiàn)，sps各組的凋亡指數(shù)明顯高于正常對(duì)照組， 并且都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明ptsd大鼠杏仁核神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生凋亡，導(dǎo)致杏仁核結(jié)構(gòu)改變， 可能與ptsd杏仁核部分發(fā)病機(jī)制相關(guān)。目前，ptsd的全部發(fā)病機(jī)制機(jī)制尚未完全清楚，ptsd可能引起腦一系列神經(jīng)生化、生 理的異常，最終導(dǎo)致杏仁核損傷。因此對(duì)ptsd的發(fā)病機(jī)制還需進(jìn)一步探討。參考文獻(xiàn)1kessler rc. post-traumatic stress disorder: the burden to the individual and to society. j clinpsychiatrt,2000, 61(suppl5) 4-12.2lindauer rj, vlieger ej, jalink m, et al. effectsof psychotherapy on hippocampal volume in out-patients with post-traumatic stress disorder: a mri investigation. psychol med ，2005，35(10):14211431.3lei zhan，et al .stress-induced change of mitochondria membrane potential regulated by genomic andnon-genomic gr signaling: a possible mechanism for hippocampus atrophy in ptsd medical hypothese,2006, 66( 6), 1205-1208.4袁輝，韓芳，石玉秀 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