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文檔簡介
實驗三,細(xì)菌的簡單染色和革蘭氏染色,一、實驗?zāi)康募耙?學(xué)習(xí)微生物涂片、染色的基本技術(shù), 掌握細(xì)菌的簡單染色法。 學(xué)習(xí)并掌握革蘭氏染色法,了解革蘭氏染色法的原理及其在細(xì)菌分類鑒定中的重要性。 鞏固油鏡的使用和無菌操作技術(shù)。,二、實驗原理,簡單染色法是利用單一染料使細(xì)菌著色以顯示其形態(tài)的染色方法。常用于染色的染料主要有堿性染料、酸性染料和中性染料三大類。 堿性染料電離時,其分子染色部分帶正電荷,能和帶負(fù)電荷的物質(zhì)結(jié)合。由于細(xì)菌生長于中性環(huán)境中一般帶負(fù)電荷,所以通常采用堿性染料使其著色。 當(dāng)細(xì)菌分解糖類產(chǎn)酸使培養(yǎng)基pH下降時,細(xì)菌所帶正電荷增加,因此易被伊紅、酸性復(fù)紅或剛果紅等酸性染料著色。中性染料是前兩者的結(jié)合物又稱復(fù)合染料,如伊紅美藍(lán)、伊紅天青等。,革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學(xué)家C.Gram創(chuàng)立的。作為細(xì)菌學(xué)上最常用最重要的鑒別染色法,革蘭氏染色法可將所有的細(xì)菌區(qū)分為革蘭氏陽性菌(G+)和革蘭氏陰性菌(G)兩大類。 G菌的細(xì)胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質(zhì),而且肽聚糖層較薄、交聯(lián)度低,故用乙醇或丙酮脫色時溶解了類脂質(zhì),增加了細(xì)胞壁的通透性,使初染的結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出,結(jié)果細(xì)菌就被脫色,再經(jīng)番紅復(fù)染后就成紅色。 G+菌細(xì)胞壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高,類脂質(zhì)含量少,經(jīng)脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小,通透性降低,因此細(xì)菌仍保留初染時的顏色。,三、實驗器材,1.菌種:枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis), 大腸桿菌(Escherichia coli), 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 2. 染色劑:草酸銨結(jié)晶紫染液或齊氏石炭酸復(fù)紅染 液,革蘭氏染色液。 3. 其他:顯微鏡,酒精燈,載玻片,接種環(huán),雙層瓶 (內(nèi)裝香柏油和二甲苯),擦鏡紙,廢液缸等。,四、實驗步驟,1、簡單染色: (1)涂片:注意取菌不要太多; (2)干燥:室溫自然干燥; (3)固定:手執(zhí)玻片一端,讓菌膜朝上, 通過火焰2-3次固定(以不燙手為宜); (4)染色:涂片加草酸銨結(jié)晶紫染液或齊氏石炭酸復(fù) 紅染液 1min; (5)水洗:自來水沖洗,直至流下的無色; (6)干燥:自然晾干或用電吹風(fēng)吹干; (7)鏡檢:先低倍觀察,再高倍觀察,并找出適當(dāng)?shù)?視野后,將高倍鏡轉(zhuǎn)出,在涂片上加香柏 油,油鏡觀察細(xì)菌的形態(tài)。,2、革蘭氏染色 (1)制片:制片方法與簡單染色相同; (2)初染:加適量(以剛好覆蓋菌膜為 宜)的結(jié)晶紫染色液染色1-2min,水洗; (3)媒染:碘液媒染1min,水洗; (4)脫色:連續(xù)滴加95%乙醇脫色20-30s至流出液無色, 立即水洗; (5)復(fù)染:滴加番紅復(fù)染約2min,水洗; (6)鏡檢:干燥后,油鏡鏡檢觀察。 (7)混合涂片法:按上述方法,在同一載玻片上,以大腸 桿菌和枯草芽孢桿菌或大腸桿菌和金黃色葡 萄球菌作混合涂片、染色、鏡檢進(jìn)行比較。,Gram Stain,G+,干燥、固定,結(jié)晶紫染色,G-,碘液媒染,乙醇脫色,蕃紅復(fù)染,Figure Mixed culture of large Gram positive rod and small Gram negative rods.,五、注意事項,革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是酒精脫色。如脫色過度,革蘭氏陽性菌也可被脫色而染成陰性菌;如脫色時間過短,革蘭氏陰性菌也會被染成革蘭氏陽性菌。脫色時間的長短受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影響,難以嚴(yán)格規(guī)定。 染色過程中勿使染色液干涸。用水沖洗后,應(yīng)吸去玻片上的殘水,以免染色液被稀釋而影響染色效果。 選用幼齡的細(xì)菌。若菌齡太老,由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽性菌轉(zhuǎn)呈陰性反應(yīng)。,六、
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