實驗七細胞骨架觀察.pptVIP

細胞骨架組分的 熒光染色觀察,實驗?zāi)康?掌握細胞骨架的顯示方法 掌握熒光顯微鏡的使用方法 了解熒光顯微鏡下細胞骨架的基本形態(tài)結(jié)構(gòu),背景知識,常用熒光探針介紹,狹義的細胞骨架指細胞質(zhì)骨架，包括微絲、微管和中間纖維。 廣義的細胞骨架包括細胞核骨架、細胞質(zhì)骨架、細胞膜骨架和細胞外基質(zhì)。,細胞骨架,2019/7/15,微管,2019/7/15,微絲,2019/7/15,中間纖維,背景知識,S.D.Pone用考馬斯亮藍染人皮膚成纖維細胞的細胞骨架獲得成功。1982年上海植物生理所陳梓卿采用植物細胞為材料也獲成功。實踐證明這是一種簡單易行的方法。 當(dāng)細胞用適當(dāng)濃度的triton X -100溶液（聚乙二醇辛基苯基醚，一種非離子去垢劑）處理，能夠溶解質(zhì)膜結(jié)構(gòu)中及細胞內(nèi)許多蛋白質(zhì)，而微絲束結(jié)合得比較緊密，不容易被去除 ，經(jīng)固定和染色后，可在光鏡下觀察到由微絲組成的纖維束。,細胞骨架研究中常用藥物,實驗原理,鬼筆環(huán)肽(phalloidin) 是從一種毒性菇類中分離的劇毒生物堿，它同細胞松弛素的作用相反, 只與聚合的微絲結(jié)合, 而不與肌動蛋白單體分子結(jié)合。它同聚合的微絲結(jié)合后, 抑制了微絲的解體, 因而破壞了微絲的聚合和解聚的動態(tài)平衡。 由于鬼筆環(huán)肽非常特異地結(jié)合并穩(wěn)定聚合態(tài)肌動蛋白, 因而對肌動蛋白的動態(tài)平衡造成嚴(yán)重影響. 此外, 較高濃度的鬼筆環(huán)肽對細胞有毒害作用. 因此, 用鬼筆環(huán)肽標(biāo)記微絲并不是用于研究活體細胞的理想方法.,G-actin,F-actin,ATP、 Mg2+、高K+、Na+,Ca2+、低Na+、K+,實驗步驟,材料： CHO（中國倉鼠卵巢細胞）、雞胚成纖維細胞 試劑： 1.PEM：50mM pipes (pH6.9), 5mM EGTA, 5mM MgSO4, 0.225M 山梨醇 2.0.5% Triton X-100溶于PEM緩沖液中。 3.4%多聚甲醛溶于PEM緩沖液中。,取出蓋片，于小平皿中37預(yù)溫 PEM洗3次(每次 1mL),Triton X-100處理約10min(1mL),37預(yù)溫 PEM洗3次(每次 1mL),37預(yù)溫 4%多聚甲醛固定細胞15min (1mL),37預(yù)溫 PEM洗3次,55nM Alex -phalloidin 10L濕盒中室溫染色30min。,37預(yù)溫 PEM洗數(shù)3次,滴加10L Ho.33342復(fù)染色,用小砂輪切去長方形蓋玻片的一角作為標(biāo)記以便識別細胞面。 細胞密度60-80%,注意蓋玻片的正反面,切勿產(chǎn)生氣泡！,在parafilm 膜上加PEM ，待蓋玻片被沖起后，再輕輕揭下蓋玻片。,避光操作,熒光鏡下觀察,注意事項,注意不要弄碎蓋片，分清細胞所在面； 各步洗細胞要輕，勿使細胞脫落； 熒光觀察注意避光操作 節(jié)約試劑。,思考題,PEM