蛋白質(zhì)工程在醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用.ppt

蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用,第一節(jié) 抗體工程,抗體(antibody)是抗原刺激人或動物機(jī)體的免疫系統(tǒng)后，由B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞產(chǎn)生的、能與抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白。 抗體可與細(xì)菌、病毒或毒素等抗原結(jié)合，并通過特定的方式清除異物。,第一節(jié) 抗體工程,抗體工程(antibody engineering)是通過對抗體分子結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系的研究，有計(jì)劃地對抗體蛋白序列進(jìn)行改造，改善抗體某些功能的技術(shù)。,抗體的分類,根據(jù)抗體的制備方法和技術(shù)，將抗體分為多克隆抗體、單克隆抗體和基因工程抗體三類。,抗體的分類,多克隆抗體：傳統(tǒng)的抗體制備的方法是將天然抗原經(jīng)過各種途徑免疫動物，因?yàn)榭乖晕镔|(zhì)具有多種抗原決定簇，所以刺激機(jī)體產(chǎn)生了多種B細(xì)胞克隆針對不同抗原決定簇產(chǎn)生的混合抗體，并合成和分泌各抗體到血清和體液中，這種用體內(nèi)免疫法所獲得的免疫血清。,單克隆抗體 當(dāng)抗原進(jìn)入體內(nèi)，在機(jī)體中就會誘導(dǎo)出針對不同抗原決定簇的多種抗體，如果要把這些抗體一一分開，用現(xiàn)有的生物化學(xué)或物理化學(xué)方法是根本辦不到的。1975年科勒和米爾斯坦將小鼠免疫細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞融合，培養(yǎng)出既能迅速生長繁殖又可分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞。從而獲得針對某一特殊抗原決定簇的單克隆抗體。,6,南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,抗體的分類,單克隆抗體：同一克隆的細(xì)胞可合成和分泌在理化性質(zhì)、分子結(jié)構(gòu)、遺傳標(biāo)記及生物學(xué)特性等方面都完全相同的均一性抗體。,1 人一鼠嵌合抗體(Chimeric Antibodies),人一鼠嵌合抗體是將鼠源單抗的可變區(qū)與人抗體的恒定區(qū)融合而得到的抗體。,構(gòu)建嵌合抗體的大致過程是，將鼠源單抗的可變區(qū)基因克隆出來，連到包含有人抗體恒定區(qū)基因及表達(dá)所需的其它元件(如啟動子、增強(qiáng)子、選擇標(biāo)記等)的表達(dá)載體上，在哺乳動物細(xì)胞(如骨髓瘤細(xì)胞、CHO細(xì)胞)中表達(dá)。,構(gòu)建重組表達(dá)載體,克隆鼠單抗的可變區(qū)基因，可從基因組文庫中分離，也可用PCR技術(shù)分離。 人抗體恒定區(qū)可根據(jù)需要選擇，不同的恒定區(qū)會帶給嵌合抗體不同功能。為避免人抗體的恒定區(qū)產(chǎn)生不需要的副作用，可通過點(diǎn)突變來修飾調(diào)整其效應(yīng)。,人一鼠嵌合抗體與鼠單抗相比，免疫原性大大降低，利于在人體內(nèi)應(yīng)用，所以目前已制備出上百種抗各種抗原(包括腫瘤相關(guān)抗原)的嵌合抗體。,2 鼠單抗可變區(qū)的人源化,盡管嵌合抗體的免疫原性已降低很多，但有時它仍可能引發(fā)較強(qiáng)的免疫反應(yīng)。為了進(jìn)一步降低抗體的鼠源成分，發(fā)展出CDR移植技術(shù)。 CDR即互補(bǔ)決定區(qū)。Ig超變區(qū)氨基酸殘基的種類和順序特別多變，這些部位與識別抗原直接相關(guān)，為Ig分子的抗原結(jié)合部位，故稱為互補(bǔ)決定區(qū)。 CDR移植即把鼠抗體的CDR序列移植到人抗體的可變區(qū)內(nèi)，所得到的抗體稱CDR移植抗體或改型抗體，也就是人源化抗體。,經(jīng)過CDR移植，抗體的免疫原性極低，而其抗原結(jié)合能力保持不變，結(jié)合半抗原及全抗原(如細(xì)胞表面受體、病毒等)的改形抗體都已有報(bào)道，到現(xiàn)在已有數(shù)百種人源化抗體。（美國正式上市的11種治療性單抗中多數(shù)是改型抗體）,人源化抗體的構(gòu)建可用全合成法或定點(diǎn)突變法。 全合成法是以人抗體序列為骨架，以鼠抗體的CDR置換人抗體的CDR，將整個可變區(qū)序列的兩條鏈分解成若干片段，并使相鄰的片段具有彼此互補(bǔ)的粘性末端。合成所有DNA片段，每組片段分別退火，然后逐組連接成完整的可變區(qū)基因，插入質(zhì)粒中，進(jìn)一步即可用于構(gòu)建和表達(dá)改形抗體。,定點(diǎn)突變法是將人的可變區(qū)基因克隆，根據(jù)鼠抗體的CDR 序列合成幾種突變引物，用定點(diǎn)突變的方法將人的可變區(qū)基因的CDR序列變?yōu)槭罂贵w的CDR序列，然后表達(dá)出改型抗體。,研究表明，在構(gòu)建改形抗體時，簡單地進(jìn)行CDR替換并不能保證抗體具有好的親和力，因此在構(gòu)建時還必需包括對影響抗原結(jié)合位點(diǎn)的空間結(jié)構(gòu)的框架序列進(jìn)行操作。,定點(diǎn)突變法是將人的可變區(qū)基因克隆，根據(jù)鼠抗體的CDR 序列合成幾種突變引物，用定點(diǎn)突變的方法將人的可變區(qū)基因的CDR序列變?yōu)槭罂贵w的CDR序列，然后表達(dá)出改型抗體。,研究表明，在構(gòu)建改形抗體時，簡單地進(jìn)行CDR替換并不能保證抗體具有好的親和力，因此在構(gòu)建時還必需包括對影響抗原結(jié)合位點(diǎn)的空間結(jié)構(gòu)的框架序列進(jìn)行操作。,小分子抗體包括Fab、Fv或ScFv、單域抗體及最小識別單位等幾種。 小分子抗體有很多優(yōu)點(diǎn): 可以用細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)，成本低; 分子小，穿透力強(qiáng); 不含F(xiàn)c，沒有Fc帶來的效應(yīng); 在體內(nèi)循環(huán)的半衰期短，易清除，利于解毒排出; 易于與毒素或酶基因連接，便于直接獲得免疫毒素或酶標(biāo)抗體等。,3 小分子抗體,Fv,ScFv,單區(qū)抗體,最小識別單位,Fab,由完整的輕鏈和Fd組成，大小為完整分子的1/3。 把Fab與細(xì)菌的前導(dǎo)肽相連，在前導(dǎo)肽的作用下Fab進(jìn)入質(zhì)周腔，裝配折疊后，它具有結(jié)合抗原的活性。,(1)Fab,Fv、ScFv的大小約為全分子的1/6。,(2)Fv 或 ScFv,Fv,ScFv,連接肽,Fv由VH與VL構(gòu)成，由于其結(jié)合是非共價結(jié)合，故Fv不穩(wěn)定。 在VH與VL之間加上一段連接肽，把VH與VL連成一條單鏈，得到ScFv，即單鏈抗體。 連接肽的長度在10-15個氨基酸左右，不宜太長或太短，它應(yīng)具有柔軟性，側(cè)鏈少，抗原性弱等特點(diǎn)。常用的連接肽是(GGGGS)3。,單鏈抗體的構(gòu)建在已知親本DNA序列時可用完全人工合成法; 在具備親本單抗可變區(qū)的cDNA克隆時，可用定點(diǎn)突變法在其兩端造成適當(dāng)?shù)膬?nèi)切酶位點(diǎn)，與人工合成的連接肽編碼序列連接，組裝到表達(dá)載體中; 如果從雜交瘤細(xì)胞系構(gòu)建單鏈抗體，可用PCR方法擴(kuò)增可變區(qū)基因，再組裝到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體上。,單鏈抗體最常用的表達(dá)體系是大腸桿菌，有2種方式: 一是表達(dá)為包涵或非包涵體的不溶蛋白。產(chǎn)量高，可達(dá)細(xì)菌蛋白總量的5%-20%，但需進(jìn)行變性復(fù)性，使其形成正確的立體結(jié)構(gòu)，恢復(fù)抗體活性; 二是分泌型表達(dá)，將細(xì)菌的信號肽序列與單鏈抗體的氨基端相連，單鏈抗體分子就可分泌到質(zhì)周腔和細(xì)菌體外，進(jìn)行折疊后成為有活性的分子。但產(chǎn)量不及前者，一般實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下每升細(xì)菌的產(chǎn)量僅在數(shù)毫克左右。,即為VH，約為完整分子的1/12。它只由一個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，故稱單域抗體。單域抗體盡管親和力有所降低，但仍保持著原單抗的特異性。,(3)單域抗體,VH,約為完整分子的1/80-1/70大小，一般由一個CDR構(gòu)成，它也保持著抗體的特異性。,(4)最小識別單位,CDR,4 雙特異抗體和多價抗體,雙鏈抗體 （Diabody）一詞最早由Hollinger等于1993年創(chuàng)造。乃是一種小分子的雙價雙特異性抗體片段。,雙特異性抗體(bispecific antibody,BSAb)是指能同時識別2種抗原的抗體。1種為對應(yīng)腫瘤相關(guān)抗原。另1種為對應(yīng)效應(yīng)成分。 即能結(jié)合靶腫瘤細(xì)胞又能結(jié)合高細(xì)胞毒性的效應(yīng)細(xì)胞,將效應(yīng)細(xì)胞富集在腫瘤周圍,而且可以模擬天然配體的作用,與細(xì)胞表面引發(fā)分子結(jié)合,激活效應(yīng)細(xì)胞,實(shí)現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞的殺傷和裂解。,Hollinger等巧妙地將抗原抗體的輕鏈可變區(qū)基因(VLA)與抗抗原抗體的重鏈可變區(qū)(VHB)通過短肽連接子連接;同樣地,將VHA與VLB連接,將兩組嵌合基因置于雙順反子的表達(dá)質(zhì)粒中,構(gòu)建成雙鏈抗體的表達(dá)質(zhì)粒,目前報(bào)道的表達(dá)質(zhì)粒均為雙順反子。表達(dá)后,VLA VHB與VHA VLB交叉連結(jié),形成雙特異性抗體。,所以雙特異性抗體與既往腫瘤免疫治療相比,除了能特異性識別腫瘤細(xì)胞外,還能將循環(huán)血液中的免疫效應(yīng)細(xì)胞再導(dǎo)向至腫瘤細(xì)胞處,從而使效應(yīng)細(xì)胞的抗腫瘤活性增強(qiáng),發(fā)揮免疫導(dǎo)向作用,這是腫瘤治療的新突破。,抗體庫技術(shù)是用基因工程方法把人或其他動物的全部抗體的輕、重鏈可變區(qū)基因克隆出來，在原核載體上表達(dá)，然后篩選出所需的特異基因和抗體。 PCR技術(shù); 免疫球蛋白Fab片段在大腸桿菌中的成功表達(dá); 噬菌體表面展示文庫技術(shù)。,5 抗體庫技術(shù),初期的抗體庫技術(shù)是從淋巴細(xì)胞中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA或直接用總DNA為模板，用PCR技術(shù)建立輕、重鏈文庫，在大腸桿菌中表達(dá)后篩選。,它是在PCR技術(shù)和Phage Display的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)的。其過程是把用PCR法得到的抗體基因插入絲狀噬菌體的DNA，與噬菌體外殼蛋白的基因相連，在輔助噬菌體的幫助下，噬菌粒包裝成絲狀噬菌體，抗體分子通過與P 或P相連，在噬菌體表面的一端或分散分布，然后可直接對噬菌體表面的抗體分子進(jìn)行篩選。,噬菌體抗體庫技術(shù),1990年Mc Cafferty等成功地建立了噬菌體表面展示系統(tǒng)，通過將抗溶菌酶單鏈抗體基因克隆于fd噬菌體基因3的下游，使ScFv以融合蛋白的形式展示于噬菌體表面，利用親和層析，兩輪富集達(dá)106倍。該技術(shù)的成功給抗體基因的篩選工作帶來了革命性的變革。,噬菌體表面展示系統(tǒng)(phage surface display system ),噬菌體表面展示文庫技術(shù)的要點(diǎn):,外源基因表達(dá)多肽以融合蛋白形式展示在外殼蛋白N端,將基因組合文庫插入噬菌體編碼膜蛋白的基因 g3或g8 的先導(dǎo)系列的緊靠下游,隨機(jī)克隆入相應(yīng)載體形成組合文庫,從免疫或未被免疫的B細(xì)胞中PCR擴(kuò)增抗體全套基因片段,用固相化抗原經(jīng)“親和結(jié)合一洗脫一擴(kuò)增”數(shù)個循環(huán)直接、方便、簡捷、高效地篩選出表達(dá)特異性好、親和力強(qiáng)的抗體噬菌體庫。,使翻譯出的抗體分泌到細(xì)菌的質(zhì)周腔內(nèi)，形成游離的抗體片段，經(jīng)過純化即可獲得目的抗體。,篩選到的噬菌體再將基因g3或g8切除后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌，,該項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn): 將抗體的基因型和表型緊密