榮莉酸甲酯對(duì)甘西鼠尾草葉丹參酮I及丹參酮ⅡA的含量影響.doc

榮莉酸甲酯對(duì)甘西鼠尾草葉丹參酮I及丹參酮A的含量影響 李文淵王津慧童麗熱增才旦李秉岳 青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，青海西寧810000 【摘要】目的：分析茉莉酸甲酯（MJ）對(duì)栽培甘西鼠尾草葉丹參酮類成分含量的影響，為甘西鼠尾草的開發(fā)提供依據(jù)。方法：采用液-質(zhì)聯(lián)用的方法，對(duì)MJ處理的甘西鼠尾草葉樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果：甘西鼠尾草經(jīng)MJ處理后的120h內(nèi)丹參酮IIA的含量均高于對(duì)照組，丹參酮I的含量從120h開始高于對(duì)照組。結(jié)論：MJ能促進(jìn)甘西鼠尾草葉中丹參酮I及丹參酮IIA含量的積累，可以考慮在人工種植中加以應(yīng)用。 關(guān)鍵詞茉莉酸甲酯；甘西鼠尾草；丹參酮 【】R282.2【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A【】1007-8517(xx)03-0029-01 使用非生物誘導(dǎo)子茉莉酸甲酯對(duì)甘西鼠尾草進(jìn)行處理，研究處理后0240h內(nèi)甘西鼠尾草葉片丹參酮I及丹參酮IIA的含量變化，旨在為今后在甘西鼠尾草種植過程中提高丹參酮類的含量提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 1儀器及材料 1.1儀器人工氣候室；Agilent1100型系列高效液相色譜儀（G1312A四元梯度泵、G1313A自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱、G1315ADAD檢測(cè)器以及色譜工作站，美國Agilent公司）；Agilent1100LC-ESI-TARP高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（盤式自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測(cè)器、二元泵、在線脫氣機(jī)以及AnalystMSD工作站，美國Agilent公司）；旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)儀（瑞士Bchi公司）；SovallEvolutionRC型高速離心機(jī)。 1.2材料甘西鼠尾草SalviaprzewalskiiMaxim種苗，采自青海省同仁縣中藏藥種植基地；茉莉酸甲酯（批號(hào)：P05202）購自美國Sigma公司。 2方法 2.1MJ的配制以無水乙醇為助溶劑，配制50%的母液。 2.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及處理設(shè)3個(gè)重復(fù)（并相應(yīng)設(shè)立對(duì)照組）分別將幼苗移栽至人工氣候室，待幼苗長出三片復(fù)葉時(shí)在葉片上均勻噴施MJ和蒸餾水，噴后立即套上保鮮袋，分別于MJ處理后0、12、24、48、120、240h后收獲葉片材料，將葉片置于60烘箱烘干6h，取出粉碎，過50目篩后用棕色瓶保存。 2.3甘西鼠尾草丹參酮類成分的測(cè)定 2.3.1對(duì)照品溶液的制備稱取2個(gè)丹參對(duì)照品適量，混合，用70%甲醇適量溶解，作為丹參對(duì)照品溶液，用于化合物對(duì)照確認(rèn)。 2.3.2供試品溶液的制備取約30mg的藥材粉末，置于11ml不銹鋼管中，采用高壓溶劑萃?。ˋSE）按以下條件提?。禾崛∪軇?00%甲醇；壓力1500Pa；溫度150；提取時(shí)間10min；置換體積60%；提取次數(shù)1次。提取液減壓濃縮至10ml，加水定容至25ml。0.45m濾膜過濾，續(xù)濾液保存于4冰箱用于HPLC分析。 2.3.3色譜分離條件色譜柱：PrevailC18rocketcolumn（33mm7mm，3.0m)；柱溫30；檢測(cè)波長280nm；進(jìn)樣量10l；溶劑組成：20mMAmmoniumAcetate（A），A（B）；流速：2.5ml/min。梯度洗脫：015min，5%15%B；1530min，15%80%B，3035min，80%5%B，3540min，5%5%B。 2.3.4質(zhì)譜檢測(cè)條件質(zhì)譜條件：霧化壓力40Pa；干燥氣流速10ml/min；干燥溫度325；化合物穩(wěn)定性（poundstability）10%；掃描范圍100800amu；015min，負(fù)離子檢測(cè)；1530min，正離子檢測(cè)。 2.3.5線性關(guān)系及檢測(cè)限取對(duì)照品混合溶液分別進(jìn)樣，色譜條件下分析，以各種化合物峰面積Y為縱坐標(biāo)，化合物含量X為橫坐標(biāo)，得到線性回歸方程如表1所示。在線性范圍內(nèi)，各種進(jìn)樣量對(duì)數(shù)值與峰面積的對(duì)數(shù)值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。當(dāng)信噪比為3時(shí)，測(cè)定各種化合物含量的檢測(cè)限在0.0028.0mg/ml之間。 2.3.5精密度實(shí)驗(yàn)在“2.3.4”項(xiàng)色譜條件下，精密吸取對(duì)照品混合溶液10l，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定。峰面積的RSD在1%4%，說明本法精密度良好。 2.3.6重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)取同一批樣品按供試品溶液制備方法平行制備5份，分別進(jìn)樣10l，測(cè)得峰面積的RSD在4%5%。 2.3.7供試品溶液穩(wěn)定性在“2.3.4”項(xiàng)色譜條件下，取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24h進(jìn)樣5次，測(cè)得RSD在3%5%，說明樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定。 2.3.8回收率實(shí)驗(yàn)按供試品溶液制備方法操作后，測(cè)定，計(jì)算，結(jié)果平均回收率為91.2%110.2%，RSD為3%6.0%。 3結(jié)果 實(shí)驗(yàn)應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用方法，測(cè)定了茉莉酸甲酯作用下0240h內(nèi)甘西鼠尾草中丹參酮I（TanshinoneI）、丹參酮IIA（TanshinoneIIA）成分的含量，本方法提取回收率均在91.2%110.2%之內(nèi)，日內(nèi)和日間精密度RSD均小于10%，最低檢測(cè)限在0.0028.0mg/ml，標(biāo)準(zhǔn)曲線在測(cè)量濃度范圍內(nèi)線性良好（r0.99）。故此法具有較高的靈敏度和專屬性，可用于復(fù)雜樣品中上述成分的含量測(cè)定。 4討論 茉莉酸甲酯是茉莉?qū)偎剀盎ㄖ邢憔偷挠袣馕痘衔?，也是茉莉中特殊香味的重要組成成分，它在其他植物中亦有廣泛分布。研究發(fā)現(xiàn)它在植物細(xì)胞的多種逆境反應(yīng)中起信號(hào)介導(dǎo)的作用，引起細(xì)胞抗逆反應(yīng)產(chǎn)物的表達(dá)1-2。王學(xué)勇等3用茉莉酸甲酯誘導(dǎo)丹參毛狀根，采用高效液相色譜法檢測(cè)處理2d、6d、9d后丹參毛狀根中隱丹參酮、丹參酮IIA的含量以及其在培養(yǎng)基中的含量，結(jié)果表明茉莉酸甲酯能顯著提高丹參酮類成分在丹參毛狀根中的積累并刺激其向培養(yǎng)基中釋放。李明等4對(duì)茉莉酸甲酯處理的丹參莖葉中丹酚酸和丹酚酸B含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明外施茉莉酸甲酯能促進(jìn)甘西鼠尾草葉片中丹參酮類成分的積累。本實(shí)驗(yàn)對(duì)甘西鼠尾草幼苗噴施MJ，如圖1所示，與對(duì)照組相比，甘西鼠尾草被MJ處理后，丹參酮IIA的含量從12h開始呈增長趨勢(shì)，在處理后240h，其含量達(dá)到最高。丹參酮I的含量從120h開始呈增長趨勢(shì)，在240h，其含量達(dá)到最高。在MJ處理240h，甘西鼠尾草中丹參酮IIA的含量是對(duì)照組的2.97倍，丹參酮I的含量達(dá)到對(duì)照組的6.3倍。由此可見，MJ可以顯著提高甘西鼠尾草中丹參酮I及丹參酮IIA的含量，在甘西鼠尾草人工種植過程中，MJ可以考慮加以應(yīng)用。 參考文獻(xiàn) 1ParchmannS，GundlachH，MuellerMJInductionof12-Oxo-phytodienoicacidinwoundedplantsandelicitedplantcellculturesJPlantPhysl，1997，115(3)：1057 2BohlandC，BalkenhohlT，LoersG，etalDifferentialinductionoflipoxyfenaseisoformsinwheatupontreatmentwithrustfunguselicitor，chitinoligosaharideschitosanandmethyljasmonateJPlantPhysl，1997，114(2)：679 3王學(xué)勇丹參毛狀根基因誘導(dǎo)表達(dá)分析及其有效成分生物合成基因的克隆研