基層醫(yī)院呼吸道合胞病毒檢測(cè)方法的篩選.docVIP

基層醫(yī)院呼吸道合胞病毒檢測(cè)方法的篩選 許琴林素香鄭水華 珠海第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東珠海519000 摘要目的篩選快速、可靠、易推廣的適合基層醫(yī)院的呼吸道合胞病毒(respiratorysycytialvirus,RSV)的檢測(cè)方法。方法雙抗體夾心ELISA法、直接免疫熒光法、免疫層析金標(biāo)法、橋聯(lián)酶標(biāo)法檢測(cè)50例經(jīng)臨床確診為RSV感染患兒的鼻咽分泌物。結(jié)果RSV陽(yáng)性檢出率依次為40%、88%、84%、80%。結(jié)論直接免疫熒光法快速、可靠、易推廣，是基層醫(yī)院RSV感染早期診斷的優(yōu)選方法。 關(guān)鍵詞呼吸道合胞體病毒；直接免疫熒光 R725.6A1672-5654（xx）07（a）-0022-02 呼吸道合胞病毒是嬰幼兒呼吸道嚴(yán)重感染的最重要的病毒病原之一，流行面廣、發(fā)病率高1-2。目前尚無(wú)特異預(yù)防措施，RSV感染及其預(yù)后是嚴(yán)重的公共健康問(wèn)題?；鶎俞t(yī)院迫切需要一種快速、可靠、易推廣的RSV早期診斷方法。本研究選擇50例PCR-熒光探針和臨床確診的RSV感染患兒鼻咽分泌物，分別用雙抗體夾心ELISA、直接免疫熒光法(DFA)、免疫層析金標(biāo)法（ICA）、橋聯(lián)酶標(biāo)法(APAAP)檢測(cè)呼吸道RSV抗原，為基層醫(yī)院篩選快速、準(zhǔn)確、方便的檢測(cè)方法。 1資料與方法 1.1一般資料 收集xx年3-4月珠海第二人民醫(yī)院住院患兒50例（男28、女22例）,年齡（012歲），經(jīng)PCR-熒光探針和臨床確診的RSV感染患兒的鼻咽分泌物。 1.2試劑與儀器 D3UltraTMDFA試劑盒(Quidel)、雙抗體ELISA試劑盒（北京科斯塔）、單克隆抗體橋聯(lián)酶標(biāo)診斷試劑盒（上海瑞齊）、RSV金標(biāo)免疫法（深圳賽爾）、熒光顯微鏡（Olympus）。 1.3方法 1.3.1DFA法檢測(cè)RSV病毒抗原患兒鼻咽分泌物1mL，加PBS，吸管吹打，2000rpm離心棄上清、吸取細(xì)胞懸液25L，點(diǎn)于帶孔玻片丙酮固定。滴加熒光標(biāo)記的抗體3730min，洗片后封片，熒光顯微鏡觀察。 1.3.2金標(biāo)法ICA法向反應(yīng)板標(biāo)本孔滴加標(biāo)本,15min后觀察反應(yīng)板孔中C端和T端有無(wú)紅色圓斑。 1.3.3雙抗體夾心ELISA法取試劑盒包被板每孔滴加稀釋液和標(biāo)本,陰陽(yáng)對(duì)照孔分別加入陰、陽(yáng)對(duì)照液，置3740min，洗滌甩干加酶標(biāo)記物,置3720min,洗滌甩干加底物液。酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)比色,空白孔調(diào)零，標(biāo)本OD值與陰性對(duì)照孔OD值比值2.1為陽(yáng)性。 1.3.4堿性磷酸酶抗堿性磷酸酶橋聯(lián)酶標(biāo)法(APAAP)樣本加PBS吹打離心棄上清，細(xì)胞懸液加封閉液后沖洗；加一抗后沖洗；加二抗后沖洗；加底物液5gL甲基綠負(fù)染沖洗，普通光學(xué)鏡下(1040)鏡檢。 1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS10.0軟件,對(duì)計(jì)數(shù)資料進(jìn)行2檢驗(yàn),比較各方法間陽(yáng)性率的差別。 2結(jié)果 DFA法：熒光顯微鏡下細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)黃綠色熒光為陽(yáng)性，未發(fā)生抗原抗體特異性反應(yīng)的細(xì)胞，被Evans藍(lán)染成紅色。放大200倍時(shí)，在視野中找到2個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞，判為標(biāo)本陽(yáng)性，50例標(biāo)本中44為陽(yáng)性，RSV陽(yáng)性檢出率為88%。ICA法：反應(yīng)板孔C端和T端均出現(xiàn)紅色圓斑為RSV陽(yáng)性，反應(yīng)板孔C端出現(xiàn)紅色圓斑，T端不出現(xiàn)紅色圓斑為RSV陰性,反應(yīng)板孔C端或C端、T端均不出現(xiàn)紅色圓斑為失效，50例標(biāo)本中42為陽(yáng)性，陽(yáng)性率84%。雙抗體夾心ELISA法：50例鼻咽分泌物陽(yáng)性20例，陽(yáng)性率40%。APAAP法：普通光學(xué)顯微鏡下，RSV感染的鼻咽分泌物纖毛柱狀上皮細(xì)胞胞質(zhì)和膜可特異地染成玫瑰紅色，核呈淡藍(lán)色或無(wú)色，3個(gè)以上典型著色細(xì)胞判為陽(yáng)性，50例標(biāo)本中40為陽(yáng)性，陽(yáng)性率80%。見(jiàn)表1。 3討論 呼吸道合胞病毒是引起嬰幼兒下呼吸道感染最常見(jiàn)的病毒,這種病毒性肺炎也是嬰兒猝死的病因之一3-4。目前臨床常用檢測(cè)RSV感染的方法有分離培養(yǎng)鑒定、間接熒光免疫法、直接熒光免疫法、橋聯(lián)酶標(biāo)免疫法、核酸檢測(cè)、ELISA法。病毒分離培養(yǎng)雖是金標(biāo)法，但費(fèi)時(shí)、實(shí)驗(yàn)要求及成本高，不易獲得成功，不適合臨床早期診斷和應(yīng)急診斷需要。核酸雜交、RT-PCR技術(shù)檢測(cè)RSA感染，敏感性、特異性高，能進(jìn)行微量檢測(cè)及RSA分型（A、B亞型），但實(shí)驗(yàn)條件要求嚴(yán)格，成本高，難以在基層醫(yī)院普及。故本研究用DFA、ICA、APAAP、雙抗體夾心ELISA四種方法檢測(cè)RSV抗原，以篩選快速、準(zhǔn)確、方便的適合基層醫(yī)院檢測(cè)方法。 標(biāo)本選自xx年34月確診RSV感染小兒鼻咽分泌物。DFA、ICA、APAAP、雙抗體夾心ELISA四種方法檢測(cè)出的RSV陽(yáng)性率依次為88%(44/50)、82%(42/50)、80%(40/50)、40%(20/50)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，前3種方法,無(wú)顯著差異;雙抗體夾心ELISA法與前三種方法相比，RSV陽(yáng)性檢出率明顯低于其它三種檢驗(yàn)方法,差異有顯著性。RSV成熟時(shí),RSV病毒大部分在細(xì)胞內(nèi)5。雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)的是細(xì)胞外的病毒蛋白,當(dāng)濃度低于ELISA法檢測(cè)蛋白靈敏度的下限時(shí)檢測(cè)不到病毒蛋白；另感染RSV后,需要一定的時(shí)間才能產(chǎn)生RSV-Ag,且RSV-Ag效價(jià)低也直接影響檢測(cè)，因此該方法易造成陽(yáng)性樣本漏檢。Koetz報(bào)道,ELISA檢測(cè)RSV病毒其靈敏度不如免疫熒光技術(shù)，與本研究結(jié)果相符。ELISA法雖然易掌握，快速，但陽(yáng)性率低，不適合臨床應(yīng)用。DFA法檢測(cè)的是細(xì)胞內(nèi)的病毒蛋白,故病毒蛋白的質(zhì)量濃度相對(duì)較高,此外DFA靈敏度高，能檢出病毒的最低濃度為1.0PFU，陽(yáng)性檢出率88%為四種方法中最高。與其它三種方法相比，直接免疫熒光法靈敏度、特異性高6、操作簡(jiǎn)便，更符合基層醫(yī)院的快速、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確的診斷要求。國(guó)外對(duì)呼吸道病毒的檢測(cè)大多采用DFA檢測(cè)7。金標(biāo)ICA法陽(yáng)性率為84%，與DFA法相比，兩種檢測(cè)方法靈敏度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,與文獻(xiàn)報(bào)道一致8。金標(biāo)法操作簡(jiǎn)便快速,30min可出結(jié)果,不需要貴重儀器,故金標(biāo)法可作為基層醫(yī)院門(mén)診篩查。APAAP法在普通光學(xué)顯微鏡下可辨認(rèn)，基層APAAP可開(kāi)展,但與相比，操作步驟多，易出現(xiàn)非特異性著色，時(shí)間長(zhǎng)（34h）。 綜上所述，ELISA靈敏性、操作性最差，不適合臨床推廣使用；APAAP法步驟多，耗時(shí)長(zhǎng)，不宜推廣；金標(biāo)法靈敏度較高，可作為基層醫(yī)院門(mén)診篩查；直接免疫熒光法簡(jiǎn)單、快速、敏感度和特異性高，是基層醫(yī)院RSV感染早期診斷的優(yōu)選方法，適合基層醫(yī)院推廣應(yīng)用。 參考文獻(xiàn) 1RobinsonJ.PreventingrespiratorysyncytialvirusinfectionsJ.PaediatrChildealth,xx,16(8):487-490. 2GernJE,PappasT,VisnessCM.ComparisonoftheetiologyofviralrespiratoryillnessesininnercityandSuburbaninfantsJ.InfectDis,xx,206(9):1342-1349. 3程可萍,胡源,郎平,等.新生兒呼吸合胞病毒下呼吸道感染臨床分析J.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,xx,21(18):3823-3825. 4祝查,華子瑜.新生兒呼吸道合胞病毒肺炎182例臨床及流行病學(xué)特點(diǎn)J.實(shí)用兒科臨床雜志,xx,26(22):1719-1721. 5ZhengX，QuianzonS，MuY，eta1ComparisonoftwonewrapidantigendetectionassaysforrespiratorysyncytialviruswithanotherassayandvialcultureJJwrol，xx，31(2)：130-133 6俞小衛(wèi),王亞楠,程寶金，等.直接免疫熒光法病毒抗原測(cè)定在呼吸道感染性疾病診斷中的應(yīng)用J.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，xx,28(1):76-79. 7SadeghiCD,AebiC,Gorgievski-HrisohoM,eta1.Twelveyearsdetectionofrespiratoryvirusesbyimmunofluorescenceinhospitalisedchildren:impactoftheintroductionofanewrespiratorypicornavirusassayJ.BMCInfectDis，