Beagle犬體內(nèi)MN9202的測(cè)定及其代謝動(dòng)力學(xué).doc

Beagle犬體內(nèi)MN9202的測(cè)定及其代謝動(dòng)力學(xué)作者：楊志福，周四元，楊鐵虹，梅其炳，劉莉【關(guān)鍵詞】高效液相色譜【Abstract】AIM:Tosetupasensitiveandrapidhighperformanceliquidchromatography(HPLC)methodtodetermineMN9202andtostudyitspharmacokineticsinBeagledogs.METHODS:Themobilephaseandextractionmethodswereoptimizedbytheorthogonalexperimentaldesign.MN9202wasintravenouslyadministeredtotheBeagledogsatthedoseof0.335mg/kgandMN9202inplasmawasdetectedbyHPLC.Thepharmacokineticparameterswerecalculatedby3P97software.RESULTS:UndertheselectedHPLCconditions,theMN9202wasclearlyseparatedfrominterferenceandtheretentiontimeofMN9202waslessthan14min.WhenMN9202wasintravenouslyadministered,theplasmaconcentrationtimecurvewasfittotwocompartmentmodel.T1/2was（20032）min.andAUCwas（321479544）g・；min/L.CONCLUSION:Theanalyticalmethodwesetupissimple,sensitiveandaccurate,anditcanbeappliedtodeterminetheMN9202intheplasmaofBeagledogs.ThespeedofeliminationofMN9202ishighinBeagledogs.【Keywords】MN9202；pharmacokinetics；HPLC；halflife；orthogonaltest【摘要】目的：建立高效液相色譜法測(cè)定Beagle犬血漿中1，4二氫2，6二甲基4（3硝基苯基）3，5吡啶二甲酸甲戊酯（MN9202）的方法，并研究其代謝動(dòng)力學(xué)規(guī)律.方法：采用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化色譜分離條件.Beagle犬給予二氫吡啶類藥物MN9202(0.335mg/kg,iv)，用反相高效液相色譜法分析血漿中原型藥物濃度，血漿藥物濃度時(shí)間數(shù)據(jù)用3P97藥代動(dòng)力學(xué)軟件分析.結(jié)果：在選定的色譜條件下，MN9202和干擾能得到較好的分離，其保留時(shí)間<；14min.Beagle犬靜脈注射給予MN9202后，其體內(nèi)過(guò)程符合二室模型，T1/2為（20032）min，曲線下面積（AUC）為（321479544）g・；min/L.結(jié)論:所建立的方法穩(wěn)定、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可用于Beagle犬血漿中MN9202的濃度測(cè)定.MN9202在Beagle犬體內(nèi)代謝迅速.【關(guān)鍵詞】MN9202；藥物代謝動(dòng)力學(xué)；高效液相色譜；半衰期；正交試驗(yàn)0引言1，4二氫2，6二甲基4（3硝基苯基）3，5吡啶二甲酸甲戊酯（MN9202）是一種二氫吡啶類鈣通道阻滯劑，對(duì)角叉菜膠誘導(dǎo)的大鼠尾動(dòng)脈血栓形成有很好的保護(hù)作用1，而且可能通過(guò)阻止5HT的合成或(和)減少5HT的釋放或影響5HT受體,從而影響心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展2.但對(duì)MN9202藥代動(dòng)力學(xué)的研究還未見(jiàn)報(bào)道.我們建立Beagle犬血漿中MN9202的高效液相色譜檢測(cè)方法，觀察靜脈給予MN9202后，藥物在Beagle犬體內(nèi)的消除動(dòng)力學(xué)，可望為其臨床前研究提供依據(jù).1材料和方法1.1材料Beagle犬5只，體質(zhì)量（92）kg，由國(guó)家醫(yī)藥管理局新藥研究管理中心成都實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基地提供(質(zhì)量合格證號(hào)：四川實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理質(zhì)量合格證第63號(hào)).高效液相色譜儀(美國(guó)Beckman公司)，LD52A型離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）.色譜分析柱為C18柱(250mm4.6mm，5m，phenomenex)，流動(dòng)相組成為乙腈及水(8218,V/V),流速1mL/min.檢測(cè)波長(zhǎng)為350nm.MN9202和MN9203（內(nèi)標(biāo)）為本教研室合成，純度>；98%.用乙醇二甲基亞砜聚乙二醇400生理鹽水（10103050=VVVV）配置成0.875g/L的注射液，避光保存.乙腈（色譜純，TEDIA公司），堿化液為50mmol/L磷酸氫二鈉溶液（用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至12），其他試劑均為分析純.1.2方法精取犬血漿0.5mL，加入內(nèi)標(biāo)溶液（MN92035.00mg/L）0.05mL，混勻，加入堿化液1mL，混勻后，再加入乙醚1mL，渦流震蕩1min，離心5min（4000r/min），分取上層有機(jī)相，用乙醚提取2次，合并提取液于尖底試管中，通風(fēng)櫥中揮干.殘留物用50L甲醇溶解，取20L用于高效液相色譜分析.Beagle犬5只實(shí)驗(yàn)前12h禁食，自由飲水.MN9202按0.335mg/kg靜脈注射給于Beagle犬，分別于給藥后0,5,10,20,40,60,120,180,240,300和360min犬前腿部靜脈采集血液標(biāo)本，肝素抗凝，離心后得血漿樣品，備用.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:數(shù)據(jù)以xs表示，采用3P97藥代動(dòng)力學(xué)軟件（中國(guó)科學(xué)院北京數(shù)學(xué)研究所研制）擬合藥時(shí)曲線，選擇模型.2結(jié)果2.1方法的專屬性色譜分離良好，MN9202檢測(cè)不受內(nèi)源性雜質(zhì)峰干擾(Fig1)，MN9202的保留時(shí)間為7.5min,內(nèi)標(biāo)MN9203的保留時(shí)間為12.2min.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線取8支試管分別加入犬空白血漿0.5mL，然后分別加入不同濃度的MN9202標(biāo)準(zhǔn)液0.05mL，使其終濃度為15,50,100,200和500g/L（內(nèi)標(biāo)濃度為200g/L），按上述正交設(shè)計(jì)中血漿樣品處理項(xiàng)下操作.以血漿中MN9202濃度()為橫坐標(biāo)，MN9202與內(nèi)標(biāo)物MN9203的峰面積之比（Y）為縱坐標(biāo)，Y=0.00555-0.02396（r=0.9999，n=8），線性范圍為15500g/L.2.3回收率分別于0.5mL空白血漿中加入低、中、高3種不同濃度的MN9202溶液（含內(nèi)標(biāo)），混勻，得到20，150和400g/L不同濃度的血漿樣品，按上述正交設(shè)計(jì)中血漿樣品處理項(xiàng)下操作.將血漿中測(cè)定的樣品與內(nèi)標(biāo)峰面積之比與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)應(yīng)處峰面積比值比較，即得方法回收率，分別為(94.97.2)%,(113.05.4)%和(111.78.5)%（n=8）.2.4精密度分別于0.5mL的空白血漿中加入低、中、高3種不同濃度的MN9202溶液（含內(nèi)標(biāo)），混勻，得到15，200和500g/L不同濃度的血漿樣品，按上述正交設(shè)計(jì)中血漿樣品處理項(xiàng)下操作.然后在1d內(nèi)不同時(shí)間進(jìn)樣，測(cè)得3種濃度標(biāo)準(zhǔn)血漿的日內(nèi)精密度（RSD）分別為14.1%,4.6%和3.7%（n=8）；相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)血漿在8d內(nèi)的日間RSD分別為11.3%,6.2%和9.2%（n=8）.2.5最低檢測(cè)限分別制備濃度為8,10和15g/LMN9202的血漿樣品，每個(gè)血樣平行做8份，按上述方法處理，取以測(cè)定結(jié)果的RSD達(dá)到20和準(zhǔn)確度（平均濃度偏離配置濃度）達(dá)到20時(shí)，樣品中藥物的最低濃度為最低檢測(cè)濃度，結(jié)果為15g/L.2.6Beagle犬體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)不同時(shí)間點(diǎn)的血漿樣品，按上述正交設(shè)計(jì)中血漿樣品處理項(xiàng)下操作，測(cè)定其濃度(Fig2).采用3P97藥代動(dòng)力學(xué)軟件（中國(guó)科學(xué)院北京數(shù)學(xué)研究所研制）進(jìn)行擬合，藥時(shí)曲線符合二室模型，得藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(Tab1).表1Beagle犬MN92020.335mg/kg靜脈注射后藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)（略）3討論我們采用正交設(shè)計(jì)對(duì)血漿中MN9202的提取方法和色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，最佳流動(dòng)相配比為乙腈：水=8416（V/V），但在此流動(dòng)相配比下色譜基線不穩(wěn)，峰積分面積誤差較大，因此選擇流動(dòng)相配比為乙腈：水=8218（V/V）.由于二氫吡啶類藥物在237nm和350nm存在雙吸收現(xiàn)象，在篩選中發(fā)現(xiàn)237nm處測(cè)定內(nèi)源性物質(zhì)干擾特別強(qiáng)，所以選擇350nm測(cè)定.建立的測(cè)定血漿中MN9202的RPHPLC方法，經(jīng)回收率、精密度及工作曲線考察，表明此檢測(cè)分析方法具有靈敏、準(zhǔn)確、迅速的特點(diǎn)，符合藥代動(dòng)力學(xué)研究的基本條件.由于二氫吡啶類藥物的不穩(wěn)定性，反復(fù)凍融有可能對(duì)樣品和內(nèi)標(biāo)產(chǎn)生影響，所以本研究所檢測(cè)的均為新鮮血樣.MN9202為間硝苯地平（mnifedipine）同系物，對(duì)一系列間硝苯地平同系物的藥效學(xué)研究表明，此類藥物隨著5位酯基碳原子數(shù)目的增加其降壓活性亦隨之增強(qiáng)，但是對(duì)其藥代動(dòng)力學(xué)缺乏系統(tǒng)研究.Beagle犬靜脈注射間硝苯地平，其體內(nèi)過(guò)程符合二室模型，T1/2為116.8min3；Beagle犬靜脈注射MN9202后，在體內(nèi)代謝也符合二室模型，T1/2為（20032）min.上述結(jié)果提示：間硝苯地平同系物靜脈給藥后，在一定范圍內(nèi)，隨著間硝苯地平同系物C5位酯基碳原子數(shù)目的增加藥物的消除半衰期逐漸延長(zhǎng)；從藥代動(dòng)力學(xué)角度看，MN9202比其他間硝苯地平同系物更具優(yōu)勢(shì)，具有明顯的開(kāi)發(fā)價(jià)值.由于二氫吡啶類藥物臨床大多采用口服給藥方式，而且生物利用度很低，MN9202口服后在動(dòng)物體內(nèi)是否也存在上述現(xiàn)象，還有待進(jìn)一步探討.【參考文獻(xiàn)】1王莉莉，李志超，梅其炳，等.MN9202保護(hù)血栓大鼠尾動(dòng)脈血管作用J.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000；21(2):214-216.WangLL,LiZC,MeiQB,etal.MN9202protectionoftailarteryincarrageenaninducedthrombosisratsJ.JFourthMilMedUniv,2000；21(2):214-216.2王劍波，郭煒，梅其炳，等.鈣拮抗劑MN9202對(duì)心肌肥厚大鼠全血和心肌中5HT的影響J.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003；2