（環(huán)境科學(xué)與工程專業(yè)論文）化學(xué)生物絮凝污水處理工藝微生物種群結(jié)構(gòu)分析.pdf

摘要 鑒定、檢測(cè)技術(shù)，定性分析 ( 如特異性引物p c r - d g g e )和定量分析 ( 如f i s h 或?qū)崟r(shí)p c r)的結(jié)合將會(huì)是今后獲取活性污泥微生物種群分析的更有力的工具。 關(guān)鍵詞:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、 套式引物p c r 、 變性梯度凝膠電泳、活性污泥、微生 物種群結(jié)構(gòu) ab s t r a c t abs tract t h e s t u d y i s a p a r t o f t h e p r o j e c t s u p p o r t e d b y t h e n a t i o n a l h i g h t e c h n o l o g y r e s e a r c h a n d d e v e lo p m e n t p r o g r a m o f c h i n a ( 8 6 3 p r o g r a m ) n o . : 2 0 0 2 a a 6 0 1 3 2 0 , o p t i m i z a t i o n r e s e a r c h o n c h e mi c a l a n d b i o l o g i c a l f l o c c u l a t i o n - s u s p e n d e d p a c k e d b e d p r o c e s s . i n t h i s t h e s i s , a i m i n g e m p h a t i c a l l y a t t h e c h a r a c t e r i s t i c o f t h e c h e m i c a l a n d b i o l o g i c a l fl o c c u l a t i o n w a s t e w a t e r t r e a t m e n t p r o c e s s , t h e m i c r o b i a l c o m m u n i t y s t r u c t u r e o f t h e p r o c e s s w a s r e s e a r c h e d w i t h m o l e c u l a r b i o l o g i c a l m e t h o d , s u c h a s p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n ( p c r ) a n d d e n a t u r t i n g g r a d i e n t g e l e l e t r o p h o r e s i s ( d g g e ) . b a s e d o n t h i s , t h e d i f f e r e n c e s o f t h e m i c r o b i a l c o m m u n i ty s t r u c t u r e b e t w e e n t h e c h e m i c a l - b i o l o g i c a l fl o c c u l a t i o n p r o c e s s a n d t h e c h e m i c a l c o a g u l a t i o n p r o c e s s , 隅are t h e t r a d i t i o n a l a c t i v a t e d s l u d g e t r e a t m e n t p r o c e s s , a / o d e n i t r i f i c a t i o n p r o c e s s s t u d i e d p r e l i mi n a r i l y . t h e r e s u l t s s h o w t h a t s o m e m i c r o o r g a n i s m s e x i s t in g i n a c c l i m a t e d s l u d g e e l i m i n a t e d w h e n t h e c o a g u l a n t w a s a d d e d t o t h e r e a c t o r . t h i s i n d i c a t e s t h a t t h o u g h t h e s e m i c r o o r g a n i s m s c a n m e t a b o l i z e t h e o r g a n i c s u b s t a n c e w i th d i s s o l v e d o x y g e n i n t h e w a s t e w a t e r , t h e y c a n t a d a p t t o t h e b i o l o g i c a l a c t i o n i n t h e c h e m i c a l - b i o l o g i c a l fl o c c u l a t i o n s y s t e m. c h a n g e s t a k e p l a c e i n t h e m i c r o b i a l c o m m u n i t y s t r u c t u r e w h e n t h e c h e m - b i o fl o c c u l a t i o n t r e a t m e n t p r o c e s s a r e u n d e r t h r e e d i f f e r e n t o p e r a t i o n p a r a m e t e r . t h e m i c r o b i a l c o m m u n i t y s t r u c t u r e i n t h e r e a c t o r w i t h g r e a t s t a b i l i t y a n d a b s o r p t i o n d i s t r i b u t i o n c a n a d a p t i t s e l f t o t h e c h a n g e s o f t h e e n v i r o n m e n tth e i mp a c t b a c t e r i a t h e t h r e e p a s s a g e o f t h e r e a c t o r a r e v e r y e q u a b l e d u r i n g t h e s a m e o p e r a t i n g c o n d i t i o n . t h e r e a r e a b u n d a n t s p e c i e s i n t h e r e a c t o r , b u t t h e q u a n t it y o f t h e m i c r o o r g a n i s m i n t h e c h e m - b i o . fl o c c u l a t i o n t r e a t m e n t p r o c e s s a r e m u c h m o r e t h a n t h e c h e m i c a l c o a g u l a t i o n t r e a t m e n t p r o c e s s . t h e r e m o v a l e f f i c i e n c y o f t h e p o l l u t a n t i n t h e c h e m - b i o . fl o c c u l a t i o n r e a c t o r a r e d i s t in c t l y h i g h e r t h a n t h e c h e m i c a l c o a g u l a t i o n r e a c t o r d u e t o t h e b i o l o g i c a l a c t i o n ah s t , a c l a b u n d a n c e o f b a c t e r i a s p e c i e s w it h s t a b l e m i c r o b i a l c o m m u n i t y s t r u c t u r e a r e i n t h e s u s p e n d e d p a c k e d b e d p r o c e s s , i n c l u d i n g a l o t o f a m m o n i a o x i d i z i n g b a c t e r i a p l a y i n g a n i m p o r t a n t r o l e i n t h e r e m o v a l o f a m m o n i a n i t r o g e n . t h e a m m o n i a o x i d i z i n g b a c t e r i a c a n s u s t a i n a s t a b l e m i c r o b i a l c o m m u n i t y s t r u c t u r e w h i c h m a k e s t h e s u s p e n d e d p a c k e d b e d c a n r e s i s t t h e s h o c k i n g l o a d a n d r e m o v e t h e a m m o n i a n it r o g e n w it h h i g h e f f i c i e n c y c o m p a r i n g w i t h s e v e r a l t r a d i t i o n a l w a s t e w a t e r t r e a t me n t p r o c e s s , t h e t h e m - b i o . fl o c c u l a t i o n t r e a t m e n t p r o c e s s h a s d i f f e r e n t m i c r o b i a l c o m m u i t y s t r u c t u r e a n d t h e m o s t a b u n d a n t s p e c i e s , t h e b i o l o g i c a l a c t i o n m e c h a n i s m m a y h a s g r e a t d i s t i n c t i o n . t h i s s t u d y c l e a r l y s h o w s t h a t i t i s p o s s i b l e t o o b t a i n a v i e w o n a c t i v a t e d s l u d g e b a c t e r i a l c o mmu n i t i e s i n t h e t h e m- b i o . fl o c c u l a t i o n r e a c t o r wi t h t h e mo l e c u l a r b io lo g i c a l m e t h o d s s u c h a s p c r , g r o u p - s p e c i f i c p c r a n d d g g e . i n t h i s s t u d y , i t i s t o o s m i p l e t o a n a l y s e o n l y f o u r b a c t e r i a s p e c i e s o n l y a c c o r d i n g t o t h e t y p e o f t h e i n fl u e n . i n t h e f u t u r e , w h e n s p e c i f i c p r i m e r s w i l l b e d e s i g n e d f o r a n i n c r e a s i n g n u m b e r o f g r o u p s , a m o r e c o m p l e t e p i c t u r e o f b a c t e r i a l c o m m u n i t i e s w i l l b e o b t a i n e d . c o m b i n a t i o n o f t r a d i t io n a l m i c r o o r g a n i s m m o n i t o r t e c h n i q u e s a n d q u a l i t a t i v e ( s u c h a s d g g e w i t h g r o u p - s p e c i f i c p r i m e r s ) a n d q u a n t i t a t i v e t e c h n i q u e s ( s u c h a s f i s h o r r e a l t i m e p c r ) w o u ld b e a n e x t s t e p i n a c q u i r i n g a g o o d d e s c r i p t i v e t o o l f o r m i c r o b i a l c o m m u n i t y a n a l y s i s o f a c t i v a t e d s l u d g e s . k e y wo r d s : p c r ; n e s t e d p c r ; d g g e ; a c t i v a t e d s l u d g e ; m i c r o b i a l c o m m u n it y s t r u c t u r e 學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書 本人完全了解同濟(jì)大學(xué)關(guān)于收集、 保存、使用學(xué)位論文的規(guī)定， 同意如下各項(xiàng)內(nèi)容:按照學(xué)校要求提交學(xué)位論文的印刷本和電子版 本;學(xué)校有權(quán)保存學(xué)位論文的印 刷本和電 子版，并采用影印、縮印、 掃描、 數(shù)字化或其它手段保存論文; 學(xué)校有權(quán)提供目 錄檢索以及提供 木學(xué)位論文全文或者部分的閱覽服務(wù); 學(xué)校有權(quán)按有關(guān)規(guī)定向國(guó)家有 關(guān)部門或者機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版; 在不以贏利為目 的的前 提下，學(xué)?？梢赃m當(dāng)復(fù)制論文的部分或全部?jī)?nèi)容用于學(xué)術(shù)活動(dòng)。 學(xué) 位 論 文 作 者 簽 名 : 之 巧 2 0 0 5年 3 月 1 6 日 同濟(jì)大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明 本人鄭重聲明: 所呈交的學(xué)位論文， 是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下， 進(jìn)行 研究工作所取得的成果。 除文中己經(jīng)注明引用的內(nèi)容外， 本學(xué)位論文 的研究成果不包含任何他人創(chuàng)作的、 己公開(kāi)發(fā)表或者沒(méi)有 公 開(kāi)發(fā)表的 作品的內(nèi)容。對(duì)本論文所涉及的研究工作做出貢獻(xiàn)的其他個(gè)人和集 體， 均己在文中以明確方式標(biāo)明。 本學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明的法律責(zé)任 由本人承擔(dān)。 簽 各邊 奸 2 0 0 5 年 3月 1 6 f i 第帝 綜述 第一章 綜述 1 . 1課題研究的背景、意義 化學(xué)生物絮凝工藝是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型污水處理工藝， 它根據(jù)化學(xué) 混凝處理工藝和生物絮凝處理工藝的各自 特點(diǎn)， 將兩者有機(jī)結(jié)合起來(lái)， 達(dá)到在很 短的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)去除主要有機(jī)污染物和總磷的目的， 且污泥產(chǎn)量少、 運(yùn)行成本和 投資費(fèi) 用均較低i = 1由于 污水在整個(gè)系統(tǒng)中的水力 停留 時(shí)間 較短 所以 化學(xué)生 物絮凝工藝對(duì)于氨氮的去除效果較差， 而懸浮填料床工藝對(duì)氨氮卻有很好的去除 效果， 將兩種工藝結(jié)合起來(lái)， 就能形成一個(gè)高度集成的、 高效的物化一生化組合 工藝， 達(dá)到高效去除廢水中有機(jī)污染物和氮、 磷的目的， 是一 種適合我國(guó)大部分 地區(qū)的城市污水處理的一種新工藝。 在這樣一個(gè)化學(xué)生物絮凝一懸浮填料床組合工藝中， 研究在不同工況條件下 微生物群落結(jié)構(gòu)和污染物去除的關(guān)系， 考察化學(xué)生物絮凝污水處理工藝的微生物 種群結(jié)構(gòu)與傳統(tǒng)活性污泥法處理工藝的區(qū)別， 能夠使人們更深入地了 解化學(xué)生物 絮凝污水處理工藝的微生物作用，從而更有目的地進(jìn)行工藝的優(yōu)化研究。 傳統(tǒng)的顯微鏡觀察和培養(yǎng)分離技術(shù)可分離取得單一菌株進(jìn)行鑒定分析， 但是 這種方法受到微生物可培養(yǎng)性的限制， 實(shí)際分離出的菌株往往只占樣品中微生物 種類很小的一部分。同時(shí)對(duì)于環(huán)境樣品的培養(yǎng)分離周期一般較長(zhǎng)，工作量大。 應(yīng) 用p c r - d g g e 方法對(duì)壞境微生物進(jìn)行研究， 就可以不經(jīng)過(guò)培養(yǎng)， 直接從樣品里 提 取細(xì)菌的d n a 或r n a ，進(jìn)行p c r - d g g e ，并且可以 對(duì)一些條帶進(jìn)行測(cè)序比對(duì)出 其種群， 通過(guò)這種方法能夠直接了解樣品中細(xì)菌分布結(jié)構(gòu)， 并能大致比較相同條 件下單一菌群的生物量。目 前， 將分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用 于 環(huán)境領(lǐng)域的研究己成為 國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。 1 .2國(guó)內(nèi)外的研究現(xiàn)狀與發(fā)展動(dòng)態(tài) 1 . 2 . 1用于環(huán)境微生物的分子生物學(xué)技術(shù) 1 . 2 . 1 . 1概述 污水處理廠中的活性污泥是由數(shù)量龐大，種類豐富的微生物構(gòu)成的絮ik結(jié) 構(gòu)， 是污水處理過(guò)程的主要載體。 其中的某些微生物種群也是引起污泥膨脹、固 液分離效果差、 氣泡等問(wèn)題的罪魁禍?zhǔn)?。因而?研究活性污泥微生物種群，了解 第帝 綜述 第一章 綜述 1 . 1課題研究的背景、意義 化學(xué)生物絮凝工藝是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型污水處理工藝， 它根據(jù)化學(xué) 混凝處理工藝和生物絮凝處理工藝的各自 特點(diǎn)， 將兩者有機(jī)結(jié)合起來(lái)， 達(dá)到在很 短的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)去除主要有機(jī)污染物和總磷的目的， 且污泥產(chǎn)量少、 運(yùn)行成本和 投資費(fèi) 用均較低i = 1由于 污水在整個(gè)系統(tǒng)中的水力 停留 時(shí)間 較短 所以 化學(xué)生 物絮凝工藝對(duì)于氨氮的去除效果較差， 而懸浮填料床工藝對(duì)氨氮卻有很好的去除 效果， 將兩種工藝結(jié)合起來(lái)， 就能形成一個(gè)高度集成的、 高效的物化一生化組合 工藝， 達(dá)到高效去除廢水中有機(jī)污染物和氮、 磷的目的， 是一 種適合我國(guó)大部分 地區(qū)的城市污水處理的一種新工藝。 在這樣一個(gè)化學(xué)生物絮凝一懸浮填料床組合工藝中， 研究在不同工況條件下 微生物群落結(jié)構(gòu)和污染物去除的關(guān)系， 考察化學(xué)生物絮凝污水處理工藝的微生物 種群結(jié)構(gòu)與傳統(tǒng)活性污泥法處理工藝的區(qū)別， 能夠使人們更深入地了 解化學(xué)生物 絮凝污水處理工藝的微生物作用，從而更有目的地進(jìn)行工藝的優(yōu)化研究。 傳統(tǒng)的顯微鏡觀察和培養(yǎng)分離技術(shù)可分離取得單一菌株進(jìn)行鑒定分析， 但是 這種方法受到微生物可培養(yǎng)性的限制， 實(shí)際分離出的菌株往往只占樣品中微生物 種類很小的一部分。同時(shí)對(duì)于環(huán)境樣品的培養(yǎng)分離周期一般較長(zhǎng)，工作量大。 應(yīng) 用p c r - d g g e 方法對(duì)壞境微生物進(jìn)行研究， 就可以不經(jīng)過(guò)培養(yǎng)， 直接從樣品里 提 取細(xì)菌的d n a 或r n a ，進(jìn)行p c r - d g g e ，并且可以 對(duì)一些條帶進(jìn)行測(cè)序比對(duì)出 其種群， 通過(guò)這種方法能夠直接了解樣品中細(xì)菌分布結(jié)構(gòu)， 并能大致比較相同條 件下單一菌群的生物量。目 前， 將分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用 于 環(huán)境領(lǐng)域的研究己成為 國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。 1 .2國(guó)內(nèi)外的研究現(xiàn)狀與發(fā)展動(dòng)態(tài) 1 . 2 . 1用于環(huán)境微生物的分子生物學(xué)技術(shù) 1 . 2 . 1 . 1概述 污水處理廠中的活性污泥是由數(shù)量龐大，種類豐富的微生物構(gòu)成的絮ik結(jié) 構(gòu)， 是污水處理過(guò)程的主要載體。 其中的某些微生物種群也是引起污泥膨脹、固 液分離效果差、 氣泡等問(wèn)題的罪魁禍?zhǔn)住Ｒ蚨?研究活性污泥微生物種群，了解 第 一 章 紹述 其細(xì)菌種類和數(shù)量， 認(rèn)識(shí)細(xì)菌群落的穩(wěn)定性和研究一些功能菌在降解有毒有害物 質(zhì)過(guò)程中的作用，對(duì)提高活性污泥處理污水的效果具有重要意義。 然而， 由于研究方法的限制各種污染物處理工藝中微生物種群的研究仍然 停留在傳統(tǒng)的純菌培養(yǎng)階段， 這種利用特定培養(yǎng)基對(duì)特定微生物的培養(yǎng)方法可能 會(huì)導(dǎo)致相當(dāng)大的誤差而無(wú)法將微生物種群真實(shí)的定性出來(lái)。 再加上如選擇性培養(yǎng) 基計(jì)數(shù)等定量方法的不準(zhǔn)確性， 使得現(xiàn)今對(duì)于處理工藝中微生物對(duì) 一 處理效果關(guān)系 性的研究仍處于 “ 黑盒子”階段。 近年發(fā)展起來(lái)的分子生物學(xué)技術(shù)很好地解決了這一問(wèn)題， 該技術(shù)利用微生物 遺傳演變時(shí)遺傳訊息1 6 s r d n a 的保守性和差異性來(lái)進(jìn)行微生物細(xì)菌種類的鑒定 和定量分析。如此一來(lái)， 各種處理程序中微生物種類、 數(shù)量與處理效率間的模式 關(guān)系便可加以建立。 整個(gè)分析流程大體為:采集到的活性污泥樣品進(jìn)行預(yù)處理后，進(jìn)行d n a 提 取分離和純化，進(jìn)行p c r 擴(kuò)增以得到大量1 6 s r d n a 分子，擴(kuò)增的d n a 片段進(jìn)t 1 群落指紋分析 ( d g g e 等) ， 建立1 6 s r d n a 資料庫(kù)， d n a 測(cè)序及微生物分類鑒定， 之后還可進(jìn)行核酸探針的設(shè)訓(xùn)及微生物的定量分析。 目前， 國(guó)外該技術(shù)在活性污泥、 生物膜種群和數(shù)量分析上的研究和應(yīng)用已有 大量報(bào)道，國(guó)內(nèi)較少。 t i m o t h y 等人用p c r - d g g e 方法， 研究了 在處理制藥廢水的七段生物好氧反 應(yīng)器中的細(xì)菌群落穩(wěn)定性， 發(fā)現(xiàn)在功能穩(wěn)定的廢水處理生物反應(yīng)器中， 在l i : i運(yùn) 行條件下有著穩(wěn)定的微生物群落結(jié)構(gòu)， 并且在進(jìn)水水質(zhì)發(fā)生改變的情況 ， 微生 物群落能夠隨之發(fā)生變化，以 維持良 好的出水水質(zhì)13 1 k a z u y a w a t a n a b e 等人研究了 降解苯酚的 活性污泥中的細(xì)菌群落情況。從降 解苯酚的活性污泥中提取d n a， 進(jìn)行p c r 擴(kuò)增， 通過(guò)溫度梯度凝膠電泳分析擴(kuò)增 片段后，得到兩條主要1 6 s r d n a 條帶，其中含有兩條主要的大片段多組分苯酚 輕化酶條帶， 并測(cè)定這些條帶的核酸序列; 同時(shí)采用直接平板培養(yǎng)方法、 分批培 養(yǎng)富集后平板培養(yǎng)的方法和恒化培養(yǎng)富集后平板培養(yǎng)的方法進(jìn)行菌種分離， 通過(guò) 動(dòng) 力 學(xué) 等 的 分 析 得 到 活 性 污 泥中 降 解 苯 酚 的 主 要 菌 種v a l iv o r a x p a r a d o x u s 1 1. s u s a n n e l o g e m 。 等人用p c r - d g g e - f i s h( 熒光原 位雜交) 技術(shù) 研究 無(wú)污 泥停留的硝化反應(yīng)器中的微生物群落情況，結(jié)果表明反應(yīng)器中主要優(yōu)勢(shì)菌群為 染章 綜述 n . e u tr o p h a , 通過(guò)1 6 s r r n a 文 庫(kù)檢索到次優(yōu)勢(shì)菌群娜 一 。 t e o b a c t e r i a ， 第只優(yōu)勢(shì) 菌 群 為 c y t o p h a g a l f l e x i b a c te ; 門 ic i 李志崗等人用p c r - 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性及其統(tǒng)計(jì)分析的力 一 法，研究p y 水 處理池中環(huán)境微生物遺傳多樣性， 結(jié)果表明直接排放池污水壞境中細(xì)菌種群優(yōu)勢(shì) 種單一，水質(zhì)較好的間接排放池細(xì)菌種群比 較豐富i i 謝冰等人采用基于1 6 s r d n a 序列分析方法，分析了未受重金屬馴化和受重 金屬馴化的兩類活性污泥在重金屬作用 優(yōu)勢(shì)菌種和多樣性的變化， 結(jié)果顯小木 馴化的活性污泥系統(tǒng)多樣性減少但優(yōu)勢(shì)種的變化微小， 而馴化系統(tǒng)優(yōu)勢(shì)菌種有較 大的變化， 但多樣性基本不變。 這一結(jié)果證實(shí)馴化有助于提高微生物對(duì)重金屬的 抗 性 !了 。 1 .2 . 1 .2 d n a 提取和純化 1 ) 樣品的預(yù)處理 用于分析的土壤樣品，在采集后可以直接進(jìn)行d n a 提取，但是活性污泥樣 品通常是泥水混合物的形式， 為了 達(dá)到高度的細(xì)胞裂解率， 必須對(duì)樣品進(jìn)t 1 - 頂處 理?？梢圆捎玫念A(yù)處理包括以下 幾種: ( 1 ) 高 速離 心， 通常 離 心 速 度 在 2 5 0 0 - - 8 0 0 0 g 左 右， 離 心時(shí)間 5 - 1 0 m in iu ) ， 棄 上清液，將沉淀部分溶于無(wú)菌水。 ( 2 )玻璃珠擊打， 經(jīng)過(guò)離心后的污泥中加入數(shù)粒滅菌玻璃珠 ( 直 徑根據(jù)需要 選擇在0 . i - - 2 m m 之間) ， 在漩渦混合器上或人為搖動(dòng)幾分鐘， 這能夠打開(kāi)活性污泥 的絮凝，便于后面的細(xì)胞破碎和裂解 n , i o ( 3 )有機(jī)物去除， 在進(jìn)行總d n a 提取之前， 向污泥樣品中 加入非離子活性劑、 丙 酮、石油醚等物質(zhì)并且低速攪拌、離心，使污泥當(dāng)中的有機(jī)物的以去除，以免 影響后續(xù)的d n a 提取和p c r 擴(kuò)增過(guò)程i h l 2 ) d n a 的提取 d n a 通常與蛋白質(zhì)及部分r n a 結(jié)合成染色體存在，因此分離核酸首先要破 碎細(xì)胞，然后采用各種方法將d n a 中的蛋白質(zhì)、糖類、脂類和欲類等物質(zhì)去除 以 純化d n a 。 在提取過(guò)程中， 要保證d n a 不被內(nèi) 源或外界污染的d n a s e 降解以保 持d n a 的完整性，并要排除其他分子的污染。 常用的細(xì)胞破碎 ( 在緩沖液中)有以下幾種方法。 第 一 帝 綜述 ( 1 )機(jī)械法: 包括用組織搗碎機(jī)、玻璃勻漿器、 研缽研磨， 但是由于 機(jī)械法 在操作過(guò)程中不夠溫和， 容易使d n a 被機(jī)械破碎， 所以這種方法多用于小質(zhì)粒分 離，而在研究活性污泥過(guò)程中使用較少。 ( 2 )物理法: 反復(fù)凍融法 ( - 1 5 0c - 2 0 0c ，主要用于動(dòng)物細(xì)胞) t il l 、 冷熱交替 法 9 0 一 冰凍，主 要用于 細(xì)菌病毒) ” 、 超聲波處理法 ( 多用于微生物) ” 。 ( 3 )化學(xué)及生化法:自 溶法 ( 在一定的條件下加防腐劑，自身酶系破壞細(xì)胞， 因時(shí)間長(zhǎng)不易控制，一般少用) 、溶菌酶 ( 破壞細(xì)菌細(xì)胞壁) 、纖維素酶 用于植 物 細(xì) 胞 ) 表 面 活 性 劑( s d s 和 t r it o n x - 1 0 0 等 ) u .is :ca 各種方法的提取效率因細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、細(xì)胞大小、 d n a 分子量等而不同 般來(lái)la, 溫和的提取方法如超聲波、 溶菌酶易造成細(xì)胞裂解不完個(gè) 損失微生物 種類的問(wèn)題;而較劇烈的提取方法如強(qiáng)烈的玻璃珠擊打，又易造成d n a 片段的 破碎1 5 。因此， 根據(jù)所分析活 性污泥的 特點(diǎn)， 反復(fù) 進(jìn)行提取方法的檢驗(yàn)和修正 是極為必要的。 3 ) d n a 的純化 無(wú)論采取哪種方法提取d n a ，都有不同程度的蛋白質(zhì)、多糖以及 一il l 豁類 污染，因此進(jìn)一步純化d n a 是非常必要的，常用的方法有有機(jī)溶劑抽提、沉淀、 梯 度 離 心 法 、 用 酶 溫 和 消 化 雜 質(zhì) 等 1 13 引 。 1 . 2 . 1 . 3 p c r 反應(yīng) 1 ) p c r 的原理 經(jīng)上述步驟提取到的d n a 分子濃度相當(dāng)?shù)停灾劣跓o(wú)法直接進(jìn)行后續(xù)分析， 若要得到足夠量的d n a 濃度則需要提取相當(dāng)大量的樣品才可，這在實(shí)際應(yīng)用i 相當(dāng) 耗時(shí)且不經(jīng)濟(jì)。然而， 這個(gè)缺點(diǎn)可藉由 聚合 酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) ( p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n , p c r )的實(shí)驗(yàn)過(guò)程解決。p c r 是一種將原樣品d n a 一直復(fù)制的步驟， 藉由 加入適當(dāng)?shù)膬啥喂押似账嶙鳛榉磻?yīng)的引 物 p r i m e r ) 、四種脫氧核昔三 磷酸 d n t p , d n a 聚合酶等反應(yīng)物，利用機(jī)器反復(fù)的升溫降溫，將上面提取到的d n a ( 稱為模板d n a)片段精確擴(kuò)增。 p c r 反應(yīng)分變性、退火、延伸三步。反應(yīng)時(shí)，首先在引物d n t p 參與下對(duì)模 板d n a 進(jìn)行加熱變性。隨后，將反應(yīng)混合液冷卻至某一溫度，在這一溫度下引 物與它的靶序列發(fā)生退火。此后退火引物在d n a 聚合酶作用下得以延伸。如此 第一令 f 5 述 反復(fù)進(jìn)行變性、 退火和延伸的這種循環(huán)。 由于這種擴(kuò)增產(chǎn)物是以指數(shù)形式積累的， 經(jīng)2 5 - 3 0 個(gè)循環(huán)后， 擴(kuò)增倍數(shù)可達(dá)l o b o 2 ) p c r 引物的設(shè)計(jì)選擇 進(jìn)行p c r 反應(yīng)時(shí)， 可隨著目的的不同而設(shè)計(jì)出 針對(duì)不同特異性的引物， 也就 是說(shuō)，藉山不同的引物，可針對(duì)不同微生物分類層級(jí)進(jìn)行p c r 反應(yīng)， 其p c r 產(chǎn)物 可為具有某科、 某屬或某種微生物特性的d n a 。以硝化細(xì)菌為例活性污泥中 可進(jìn)行硝化反應(yīng)的微生物很多，通稱為硝化細(xì)菌或氨氧化細(xì)菌 ( a m m o n i a o x i d iz in g b a c t e r i a ) ， 在引 物的設(shè)計(jì)上 便可針對(duì)這些硝化細(xì)菌其1 6 s r d n a 所共同 保 留的d n a 序列設(shè)計(jì)，使得進(jìn)行p c r 反應(yīng)時(shí)可僅針對(duì)硝化細(xì)菌進(jìn)行雙股d n a 1 1 鏈 變性) 一引物結(jié)合 ( 退火) 一延伸的重復(fù)反應(yīng)， 其p c r 產(chǎn)物中所有的d n a 便皆 為具有硝化細(xì)菌特性的菌種d n a 。因此，在整個(gè)p c r 反應(yīng)中引物的設(shè)計(jì)決定了 p c r 反應(yīng)的特異性和成敗與否。 引物是與擴(kuò)增d n a 片段兩端互補(bǔ)的寡核昔酸，為單鏈d n a 片段。引物是 p c r成功的關(guān)鍵， 引物與模板退火的溫度和所需的時(shí)間取決于引物的堿基組成、 長(zhǎng)度和溶液中引物的濃度。一般引物含有1 5 - 3 0個(gè)堿基，堿基組成為g + c %占 5 06 0 %，主要根據(jù)研究目的的不同而設(shè)計(jì)。p c r擴(kuò)增時(shí)，是從引物的3 端開(kāi)始 按照5 - - 3 的方向延伸，因此引物3 端的堿基必須嚴(yán)格與模板堿基h _ 補(bǔ)，而對(duì)5 端要求則不如3 端嚴(yán)格，有時(shí)候還可在5 端加上特殊的序列使擴(kuò)增后產(chǎn)物作為探 針用于核酸檢測(cè)。 一般而一言， 作p c r 引物用的寡核若酸至少應(yīng)含1 6 個(gè)堿基，引物長(zhǎng)度愈長(zhǎng)，其 p c r 的特異性愈佳，1 8 - 2 4 個(gè)堿基是最具特異性的。根據(jù)生物基因組大小，最短 長(zhǎng)度在幾個(gè)堿基范圍內(nèi)變動(dòng)， 最好在特異性允許的范圍內(nèi)尋找安全性。 每增加 個(gè)堿基，引物特異性提高4 倍。為了防止兩對(duì)引物內(nèi)的同源性，應(yīng)特別注意引物 不能互補(bǔ)，尤其是3 末端，引物間的互補(bǔ)將導(dǎo)致不想要的引物二聚體的出現(xiàn)， 這 樣獲得的p c r 產(chǎn)物其實(shí)是引物自身的擴(kuò)增。 這將會(huì)在引物二聚體產(chǎn)物和天然模板 之間 產(chǎn)生 竟?fàn)?p c r 狀態(tài)， 從而影響 擴(kuò)增成 功 1a 1 4 1 a i l 種在環(huán)境分析領(lǐng) 域常用的引 物見(jiàn)下表1 - 1 0 第一章 綜述 表1 - 1環(huán)境分析領(lǐng)域常用的p c r 引物 k 細(xì) la放線菌酸桿菌氨氧化細(xì)9。 變形月 變形卵囊仄氧細(xì) 菌綱菌綱a l 引物 p 6 3 f r1 3 7 8 r p 3 3 8 f p 51 8 r f 2 4 3 r1 3 7 8 r 3 1 f r1 3 7 8 r ct 01 8 9 f ab ct o 1 8 9 f c ct 06 5 3 r f 2 0 3 a k 1 37 8 p 3 3 8 f b e t4 2 a mb9 a rl 3 7 8 r 參考 文獻(xiàn) 1 1 6 1 1 7 1 1 1 7 , 1 8 1 1 9 1 1 7 , 2 0 1 2 1 11 2 3 1 呼z2 3 ) d n a 聚合酶 d n a 的體外擴(kuò)增是由 耐熱的 d n a 聚合酶完成的， 通常是t a q d n a 聚合酶， t a q 酶是從生存在熱泉水中的耐熱的 水生嗜熱菌內(nèi)分離得到的， 可在高 溫 ( 7 2 -c ) 下催化d n a 合成，并且加熱至9 5 不會(huì)變性，使p c r 反應(yīng)得以自 動(dòng)化。 其 他常 用的高 溫 d n a 聚 合 酶 有 v e n t , d e e p v e n t , t l i , p w o , m1, u i t m a 等， 這些酶不僅有高的熱穩(wěn)定性，還能擴(kuò)增大于1 2 k b 的模板d n a ,史上要的是具有 校正 功能，因此比 t a g d n a 聚合酶具有更高的保真度， 尤其是p f u d n a 聚合酶其 有 超 強(qiáng) 的 糾 錯(cuò) 功 能 1 1 11 目前，這些d n a 聚合酶已經(jīng)被商品化。 4 ) 緩沖液 用于 p c r 的 標(biāo)準(zhǔn)緩沖液 含: 1 0 - - 1 5 m m o l / 1 t r i s -h c ) ( p h 8 .3 ， 室 溫) ， 5 0 m m o l / i k c i , 1 .5 - -2 m m o l/ l m 9 c i z ， 提 供 d n a 合 成 反 應(yīng)所 需 p h , 離 子 強(qiáng) 度 等 環(huán) 境。 m g z l 的存在極為重要， 它能影響引物退火的程度、 模板及p c r 產(chǎn)物的解鏈溫度、 產(chǎn)物 的特異性、酶的活性及精確性，因此反應(yīng)體系中小可含有高濃i的鰲合劑如 e d t a ，不可含有高濃度的帶負(fù)電荷的離子基團(tuán)如磷酸根等。 5 ) 脫氧核f - 三磷酸 ( d n t p ) d n t p 液包括d a t p , d g 丁 p , d c 丁 p , d 丁 丁 p ，在飽和濃度下使用，參與p c r 反 應(yīng)。但d n t p 是反應(yīng)中磷酸根的主要來(lái)源，其濃度的任何變化都將影響到磷酸根 的濃度，所以在設(shè)計(jì)反應(yīng)體系中應(yīng)予以注意。 6 ) 模板d n a 模板對(duì)p c r的影響主要有兩個(gè)方面: ( 1 ) 模板d n a的量: 模板d n a的量太 多， 易于兩條模板d n a單 鏈重新結(jié)合， 會(huì)使擴(kuò)增反應(yīng)失敗: ( 2 ) 模板的純度: 一 b 第一章 綜述 般來(lái)說(shuō)，p c r 對(duì)模板純度的要求不高，但在模板d n a溶液中，小能有蛋白質(zhì)、 核酸酶、尿素、十二烷基磺酸鈉、e d t a等影響擴(kuò)增反應(yīng)的物質(zhì)存在。對(duì)一j 幾 個(gè) 別成分復(fù)雜的環(huán)境樣品，提取的總d n a 需用專門的純化試劑盒純化后即可用于 p c r 擴(kuò)增，或?qū)⒛０逑♂? 0 - 1 0 0 倍后使用。 1 . 2 . 1 .4變性梯度凝膠電泳技術(shù) 群落指紋( c o m m u n i t y f i n g e r p r i n t ) 是指一個(gè)混合菌種經(jīng)電泳后所呈 現(xiàn)的分 布 情形。所謂電泳，是指在凝膠 ( g e l )中 通入電 場(chǎng)，由 于d n a 分子帶負(fù)電，因 此會(huì)往電 場(chǎng)中正極的方向 移動(dòng)，而g e ! 是一 種具有網(wǎng) 狀結(jié)構(gòu)的 物質(zhì)， 不同 大小的 d n a 分子在g e l 中移動(dòng)的速度也會(huì)因 此而不同，分子 量小的移動(dòng)比較快，分子 量 大的移動(dòng)比較慢，因此便可區(qū)分出不同分子量的d n a 。不同的樣品在經(jīng)過(guò)相同 的處理 ( 如d g g e ) 之后， 經(jīng)電泳后所呈現(xiàn)的相對(duì)位置可能不同，反之， 相同樣 品經(jīng)電泳后的相對(duì)位置則相同， 因此， 便可據(jù)此區(qū)分兩未知樣品之間菌種差異的 程度。變性梯度凝膠電 泳法 ( d e n a t u r in g g r a d i e n t g e l e l e c t r o p h o r e s e s ) 是一 種常 用的群落指紋分析方法。 d n a 為一雙股結(jié)構(gòu)，其兩單股間是由互補(bǔ)的堿基所形成的氫鍵所結(jié)合而成， a 與t 之間有二個(gè)氫鍵， g 與c 之間則有二個(gè)氫鍵。 如果加入尿素等可使d n a 氫鍵 打斷 ( 即變性)的物質(zhì)，則由于a 7 與g c 二種互補(bǔ)d n a 的結(jié)合力不同，將會(huì)造成 不同的變性效果，由于兩種菌種其序列a t 鍵與g c 鍵的位置不同、數(shù)量不同，其 變性程度也不同，即雙股d n a 遭到開(kāi)鏈的程度及形狀也不相同，因此電泳時(shí)兩 條序列穿過(guò)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的難易度便因而不同，而這種難易度是依d n a 序列遭變性 的程度不同來(lái)區(qū)分的。 如果在電泳過(guò)程中加上變性程度的梯度， 則更能使這種差異性加大， 進(jìn)而降 低不同樣品但有相同變性程度的機(jī)率。 在d g g e 電泳法中不同位置所呈現(xiàn)的亮帶 表示不同的1 6 s r d n a 序列，這是一段經(jīng)p c r 反應(yīng)后的完整序列，因此，不同位 置的亮帶便對(duì)應(yīng)為一單 一 菌種。 然而，由于分辨率的關(guān)系， 此亮帶需切 下 再重復(fù) 做p c r , d g g e 試驗(yàn)方能加以純化。如此，將經(jīng)純化的d g g e 亮帶進(jìn)行測(cè)序便能 得知其種群的組成。 1 .2 . 1 . 5 d n a 測(cè)序、1 6 s r d n a 文庫(kù)的建立及微生物分類鑒定 將純化的d g g e 亮帶置入水中以后，其d n a會(huì)再度溶解出來(lái)，之后，再纖 第章 綜述 由p c r 反應(yīng)將溶解于水中的d n a 進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，以獲得高濃度的1 6 s r d n a 接 著便可進(jìn)行以1 6 s r d n a 為序列的微生物測(cè)序及1 6 s r d n a 文庫(kù)的建立。 為了使回收的d n a 序列具有代表性， 通常需要選取至少1 0 0 個(gè)左右的單菌落 進(jìn)行序列回收?；厥盏男蛄凶詈萌窟M(jìn)行測(cè)序，以便進(jìn)行后續(xù)微生物分類分析。 但有時(shí)限于測(cè)序費(fèi)用， 不能將回收的全部序列測(cè)序， 則需要先進(jìn)行篩選， 剔除重 復(fù)序列，僅將代表性的、豐度較大的序列測(cè)序。序列篩選一般采用前面提到的 d n a 指紋技術(shù) ( 如d g g e )或藍(lán)白斑篩選等。 1 .2 .2微生物分類學(xué)研究進(jìn)展 生物進(jìn)化或生命的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)一直是人們所關(guān)注的熱點(diǎn)， 也是生命科學(xué)的中 心。 1 9 7 7 年w o e s e 的 r r n a 生命樹研究， 使得細(xì)菌進(jìn)化研究出 現(xiàn)了 包括了古菌 這個(gè) “ 第三生命”的新的曙光。wo e s e 在1 9 8 7 年將細(xì)菌域中可培養(yǎng)的細(xì)菌分為1 1 個(gè)類 群 12 4 1 ， 包 括: 棲 熱 袍菌目 ( t h e r m o to g a: 綠 色 非 硫細(xì)菌 ( g r e e n n o n - s u 晌r b a c te r i a ) ; 奇異球菌 ( d e i n o c o c c i ) ;螺旋體群 ( s p i r o c h e t e s ) :綠色硫細(xì)菌 ( g r e e n s u l / u r b a c t e r i a ) ; 擬桿細(xì)菌/ 黃質(zhì)菌屬 ( b a c t e r o i d e s / f l a v o b a c t e r i a ) ; 浮霉?fàn)罹?( p l a n c t o - m y c e s ) ; 衣原 體菌 ( c h la m y d i a e ) ; 革蘭氏 陽(yáng) 性細(xì)菌群 ( g r a m p o s i t i v e b a c t e r i a ) ; 藍(lán) 細(xì)菌 ( c y a n o b a c t e r i a ) ;紫細(xì)菌 ( p u r p l e b a c t e r i a ) ( 見(jiàn)圖1 - 1 ) 0 圖 1 - 1 基于 1 6 s r r n a 序列比 較 而構(gòu)成的真 細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育 樹 g a l 1 9 9 8 年n , r . p a c e 等根據(jù)環(huán)境中的1 6 s r r n a 序列的多樣性，認(rèn)為細(xì)菌域可能 由 3 6 或 4 0 多 個(gè)大 綱組成12 1見(jiàn)圖1 - 2 ) ， 其中 可 培養(yǎng)的 細(xì)菌群又 增加了 熱 脫硫桿菌 第章 綜述 由p c r 反應(yīng)將溶解于水中的d n a 進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，以獲得高濃度的1 6 s r d n a 接 著便可進(jìn)行以1 6 s r d n a 為序列的微生物測(cè)序及1 6 s r d n a 文庫(kù)的建立。 為了使回收的d n a 序列具有代表性， 通常需要選取至少1 0 0 個(gè)左右的單菌落 進(jìn)行序列回收?；厥盏男蛄凶詈萌窟M(jìn)行測(cè)序，以便進(jìn)行后續(xù)微生物分類分析。 但有時(shí)限于測(cè)序費(fèi)用， 不能將回收的全部序列測(cè)序， 則需要先進(jìn)行篩選， 剔除重 復(fù)序列，僅將代表性的、豐度較大的序列測(cè)序。序列篩選一般采用前面提到的 d n a 指紋技術(shù) ( 如d g g e )或藍(lán)白斑篩選等。 1 .2 .2微生物分類學(xué)研究進(jìn)展 生物進(jìn)化或生命的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)一直是人們所關(guān)注的熱點(diǎn)， 也是生命科學(xué)的中 心。 1 9 7 7 年w o e s e 的 r r n a 生命樹研究， 使得細(xì)菌進(jìn)化研究出 現(xiàn)了 包括了古菌 這個(gè) “ 第三生命”的新的曙光。wo e s e 在1 9 8 7 年將細(xì)菌域中可培養(yǎng)的細(xì)菌分為1 1 個(gè)類 群 12 4 1 ， 包 括: 棲 熱 袍菌目 ( t h e r m o to g a: 綠 色 非 硫細(xì)菌 ( g r e e n n o n - s u 晌r b a c te r i a ) ; 奇異球菌 ( d e i n o c o c c i ) ;螺旋體群 ( s p i r o c h e t e s ) :綠色硫細(xì)菌 ( g r e e n s u l / u r b a c t e r i a ) ; 擬桿細(xì)菌/ 黃質(zhì)菌屬 ( b a c t e r o i d e s / f l a v o b a c t e r i a ) ; 浮霉?fàn)罹?( p l a n c t o - m y c e s ) ; 衣原 體菌 ( c h la m y d i a e ) ; 革蘭氏 陽(yáng) 性細(xì)菌群 ( g r a m p o s i t i v e b a c t e r i a ) ; 藍(lán) 細(xì)菌 ( c y a n o b a c t e r i a ) ;紫細(xì)菌 ( p u r p l e b a c t e r i a ) ( 見(jiàn)圖1 - 1 ) 0 圖 1 - 1 基于 1 6 s r r n a 序列比 較 而構(gòu)成的真 細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育 樹 g a l 1 9 9 8 年n , r . p a c e 等根據(jù)環(huán)境中的1 6 s r r n a 序列的多樣性，認(rèn)為細(xì)菌域可能 由 3 6 或 4 0 多 個(gè)大 綱組成12 1見(jiàn)圖1 - 2 ) ， 其中 可 培養(yǎng)的 細(xì)菌群又 增加了 熱 脫硫桿菌 第 一 章 綜述 屬(