（微生物學(xué)專業(yè)論文）褐腐菌輔助降解纖維素活性物質(zhì)的研究.pdf

山東大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要 摘要 褐腐真菌( b r o w n r o tf u n g i ) 是降解木材能力極強的一類擔(dān)子菌，可在木素 少量被修飾或降解的情況下徹底降解木材，造成纖維索和半纖維素迅速解聚。研 究發(fā)現(xiàn)此類菌在降解纖維素時有許多獨特的地方。它是一種研究天然木質(zhì)纖維素 降解的重要的生物種類，為人們研究新的纖維素降解機制、徹底了解纖維素的微 生物降解機制和最終開發(fā)纖維素資源提供了新的途徑。 關(guān)于褐腐菌降解木質(zhì)纖維素的研究大多是以一種菌為模型進行研究的，因此 大多數(shù)結(jié)論的得出也是基于一種菌的研究，未免存在片面性，研究結(jié)論是否適用 于其他褐腐菌未曾考證。本文的第二章對褐腐真菌降解纖維素的特性進行了普遍 研究，證明了褐腐真菌在木纖材料上生長時，普遍產(chǎn)生具有產(chǎn)h 0 活性的低分 子量的物質(zhì)。 另外。鐵元素在褐腐菌的整個纖維素輔助降解體系中起著至關(guān)重要的作用。 這提示我們褐腐菌產(chǎn)生鐵螯合組分的重要作用為了更好的研究褐腐菌的氧化降 解體系，我們把研究的重點轉(zhuǎn)向了這種螯合鐵活性組分。本文第三章對褐腐菌產(chǎn) 生的這種鐵螯合物進行了一系列分離純化，獲得的初步純化的鐵螯合物，并對其 結(jié)構(gòu)性質(zhì)進行生物化學(xué)性質(zhì)分析。在第四章中，本文初步探討了這種鐵螯合物對 不同真菌、細菌的影響。 本文為研究纖維素的降解機制、開發(fā)和利用纖維素資源以及研究開發(fā)開發(fā)新 的微生物活性藥物提供了重要的實驗證據(jù)。 關(guān)鍵詞：褐腐菌、纖維素、羥自由基、鐵螯合物。 山東大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要 a b s t r a c t b r o w n - r o tf u n g ii so n eo ft h et h r e eg r o u p so fw o o d - d e c a y i n gf u n g i t h e yc a n s t r o n g l yd e c o m p o s ec e l l u l o s ea n dl i g n i n ，a n dp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nc a r b o nr e c y c l e a n df o r m a t i o no fh u m u si nn a t u r e b mt h em e c h a n i s mb yw h i c h t h e yd e g r a d e l i g n o c e l l u l o s ei ss t i l ln o tc l e a r w h i t e r o tf u n g ih a v el i g n i np c m x i d a s ca n dc e l l u l a s e s y s t e m ，c a nd e g r a d el i g n o c e l l u l o s c ；b r o w n r o tf u n g id o n th a v ee x o - g i l l 蝴ea n d l i g n i n - d e g r a d i n ge n z y m es y s t e m ，b u tt h e yc a l lg r e a t l yd e g r a d ec e l l u l o s ea n dl i g n m n o w a d a y s ，b i o d e g r a d a t i o n o f l i g n o c e l l u l o s eb y b r o w n - r o t f u n g i h a s r e c e i v e d i n c r e a s i n ga t t e n t i o n b mu n t i ln o w , m o s ts t u d i e sa r cp h e n o m e n ad e s c r i p t i o n sa n d d e d u c t i o n so f t h em e c h a n i s m 。w h i c ha r el a c ko f d i r e c te v i d e n c e i nt h es e c o n dp a r to ft h i sa r t i l e i t e s t i f yt h a t a 娃n do fl o w - m o l e c u l a r - w e i g h t s u b s t a n c e 、 r i t l lh o p r o d u c i n ga c t i v i t yi sg e n e r a l l yp r o d u c e dw h e nb r o w n - r o t f u n g i g r c w o i ll i g n o c e l l u l o s em a t e r i a l t h i sm a k e st h em e c h a n i s mo f c e l l u l o s e d e g r a d a t i o n i nt h et h i r dp a r t ，ip a r t i a l l yp u r i f i e dai r o nc h e l a t o rf r o mt h ee x t r a c e l l u l a rs u b s t a n c e a n dd i ds o m er e s e a r c ho nt h e j u d g e m e n to f s t r u c t u r a lc h a r a c t e r f u r t h e r m o r e ，ia l s o p r i m a r i l y t e s t e dt h e b i o l o g i c a l e f f e c to ft h ei r o nc h e l a t o ro no t h e r m i c r o o r g a n i s m s - - - t y p i c a lg e n u so f b a c t e r i aa n df u n g i k e yw o r d s ：b r o w n - r o tf u n g i ，c e l l u l o s e ，h y d r o x y lr a d i c a l ，i r o nc h e l a t o r 原創(chuàng)性聲明 本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨立迸 行研究所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何 其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的科研成果。對本文的研究作出重要貢 獻的個人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本聲明的法律責(zé)任由本人 承擔(dān)。 ， 論文作者簽名：j 蜱 日期：童竺堡壘! ! 關(guān)于學(xué)位論文使用授權(quán)的聲明 本人完全了解山東大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保 留或向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱 和借閱；本人授權(quán)山東大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān) 數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采用影印、縮印或其他復(fù)制手段保存論文和匯編本 學(xué)位論文。 ( 保密論文在 論文作者簽名：日期： 山東大學(xué)磺士學(xué)位論文第一攀 第一章緒論 1 1 纖維素降解的戰(zhàn)略意義 1 1 1 開發(fā)生物質(zhì)資源的戰(zhàn)略意義 生物質(zhì)是地球上數(shù)量最豐富的可再生性資源。據(jù)報道，全球每年通過光合作 用產(chǎn)生的植物質(zhì)高達l ，5 0 0 - 2 ，0 0 0 億噸1 ，相當(dāng)于目前世界能源消耗的8 1 0 倍 2 ，是石油等無法比擬的可再生資源。其中8 0 以上為木質(zhì)纖維索類物質(zhì)( 如各 種草類、樹木等都是纖維素、半纖維素和木素等聚合物的復(fù)合物) 3 0 而纖維素 占植物總千重的3 0 5 0 ，是地球上分布最廣、含量最豐富的碳水化合物。 我國的纖維素資源也很豐富，僅農(nóng)作物秸桿一項，每年可達ol o 億噸。雖然纖 維索資源是巨大的但人們對它的開發(fā)和利用卻十分有限，除了紡織、造紙和木 材工業(yè)外，只有少量低值應(yīng)用，相當(dāng)大的部分自然腐爛或燃棄，僅我國每年的各 種農(nóng)業(yè)廢棄物就有近十億噸，工業(yè)纖維性廢渣數(shù)萬噸，這無疑是對自然資源的極 大浪費。更重要的是，生物質(zhì)資源的不充分利用還造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染，威脅 著人類的生存和健康。 當(dāng)今世界存在“資源、能源、農(nóng)業(yè)、人口和環(huán)境”五大危機，緩解乃至解決 這些危機在很大程度上倚賴于生物技術(shù)的發(fā)展。植物質(zhì)資源的生物轉(zhuǎn)化和利用是 其中的一個重點。由于纖維素在造紙、紡織、化工、醫(yī)藥、建筑等領(lǐng)域的廣泛應(yīng) 用及其在國民經(jīng)濟發(fā)展中占有的重要地位，使得纖維素資源的開發(fā)利用具有重要 的意義。但是五十年代至六十年代。由于合成高分子材料的興起，纖維素資源的 開發(fā)研究受到極大的影響：七十年代初期，由于石油危機的出現(xiàn)，這種曾被忽視 的可再生性資源又再次被重視起來5 ，尤其是近年來，可持續(xù)性發(fā)展戰(zhàn)略的提出 使這一問題提升到了前所未有的高度。據(jù)資料統(tǒng)計。日本政府每年對有數(shù)百名科 學(xué)工作者參與的植物質(zhì)生物轉(zhuǎn)化系列項目的專項資助已達數(shù)十億日元。b i o m a s s 一詞原來中文注釋普遍為“生物量”，現(xiàn)在己有新釋“生物原料，這也從一個 側(cè)面說明大力開發(fā)和利用可再生資源日益成為人們的共識，幾十年來，關(guān)于木質(zhì) 纖維素的研究一直較為活躍。 山東大學(xué)碩士學(xué)位論文 第一章 1 1 2 木質(zhì)纖維素資源的利用 作為陸生植物的骨架材料，億萬年的長期歷史進化使植物纖維素類物質(zhì)具有 非常強的自我保護功能。其三類主要成分纖維素、半纖維素和術(shù)素本身均為 具有復(fù)雜空間結(jié)構(gòu)的高分子聚合物，它們相互結(jié)合形成為復(fù)雜的超分子復(fù)合物， 并進一步形成各種各樣植物細胞壁結(jié)構(gòu)。這些復(fù)雜的三維空間結(jié)構(gòu)使植物體得以 避免微生物及各種物理化學(xué)因素的攻擊。木質(zhì)纖維素材料的這種難降解性是其未 得到有效利用的主要原因。纖維素是地球上數(shù)量最多的可再生性生物質(zhì)能，微生 物對它的降解是自然界碳素循環(huán)的主要環(huán)節(jié)，利用這種轉(zhuǎn)化作用可望將其轉(zhuǎn)化 為飼料、糧食和化工原料，同時在污染的防治中也可發(fā)揮重要作用。 因此，生物質(zhì)資源充分利用的主要難題是如何克服木質(zhì)纖維素材料的這種 難降解性。阻礙著由葡萄糖組成的纖維素有效利用的最大障礙，是它被難以降解 的木素所包圍。目前在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的纖維素利用所遇到的障礙多由此而來。例 如：未木質(zhì)化的牧草中的纖維素8 0 可為牛羊體內(nèi)的微生物分解消化，而木質(zhì) 化的麥桿纖維素的可消化率僅為2 0 。已有各類提高其消化率的物理、化學(xué)預(yù) 處理方法，往往因為耗能大、成本高、污染環(huán)境等問題未能得以實用。而實現(xiàn)這 一目標(biāo)是需要對相關(guān)酶類對木質(zhì)纖維素材料的降解過程有非常深入的了解的目 前國外在這方面的研究異?；钴S，國內(nèi)也已有了良好的開端。 妨礙木質(zhì)纖維素資源生物轉(zhuǎn)化技術(shù)實用化的另一個主要障礙，是自然界中 的主要纖維降解酶類的比活力通常都比較低，致使酶的生產(chǎn)成本較高，影響了酶 的廣泛使用。隨著人們對纖維降解酶的立體結(jié)構(gòu)和作用機理認識的深入，以及基 因工程、蛋白質(zhì)工程技術(shù)的迅速發(fā)展，改造酶結(jié)構(gòu)、提高酶比活力也已成為可能。 國內(nèi)外有不少研究工作，已有通過蛋白質(zhì)工程使酶的使用性能得到改善的成功報 道。 總之，生物質(zhì)資源有效轉(zhuǎn)化的最佳途徑是使用現(xiàn)代生物技術(shù)，而生物技術(shù) 成功的關(guān)鍵是提高生物轉(zhuǎn)化的效率。組織生物、化學(xué)、輕工、化工等多學(xué)科、多 專業(yè)科技人員的大規(guī)模合作研究，努力搞清生物質(zhì)自我保護功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，深 入探討生物質(zhì)資源降解的機理，研究固體纖維素材料加工的生化工程基礎(chǔ)問題， 探尋生物質(zhì)資源轉(zhuǎn)化和廢棄物資源化的新技術(shù)是解決上述資源環(huán)境問題的關(guān) 鍵。 山末大學(xué)碩士學(xué)位論文 第一章 1 2 降解木質(zhì)纖維素的微生物類群 自然界中，伴隨著億萬年的進化歷程，出現(xiàn)了眾多能降解纖維素的微生物， 包括細菌、放線菌和真菌7 q 。初步統(tǒng)計，已發(fā)現(xiàn)具有降解纖維素能力的微生物 有近2 0 0 中。其中，絲狀真菌是研究最多的纖維素降解類群。包括木霉屬 ( t r i c h o d e r m a ) 、青霉屬( p e m c i l l i u m ) 、曲霉屬( a s p e r g i l l u s ) 的絲狀真菌和擔(dān)子菌， 其中又以木霉屬的瑞氏木霉( zr e s e e s e i ) 、康氏木霉( 7 = k o n i n g i o 、綠色木霉( t v i r i d e ) 和擬康氏木霉( t 妒s e u d o k o r d n g i o 及青霉屬的斜臥青霉d e c u m b e n s ) 、微紫青霉僻 j a n t h i n e l l u m ) 研究較多1 0 1 4p 許多菌已應(yīng)用到了工業(yè)生產(chǎn)中。它在降解纖維素底 物時，菌絲穿過次生壁進入胞腔，由內(nèi)向外降解纖維素，使纖維素逐步被破壞； 而細菌則是粘附在纖維上，從纖維的表面向內(nèi)生長，在接觸點處纖維素被降解， 使纖維表面呈鋸齒蝕痕。以纖維單胞菌屬( c e l l u l o m o n a s ) 、噬纖維菌屬 ( c y t o p h a g a ) 、生孢噬纖維菌屬( s p o r o c y t o p h a g a ) 、假單胞菌屬( p s e u d o m o n a s ) 、梭菌 屬( c l o s t r i d i u m ) 和芽孢桿菌屬( b a c i l l u s ) 中的菌研究的較多：放線菌中對高溫放線 菌屬( t h e r m o a c t i n o m y c e s ) 和小單胞菌屬( m i c r o m o n o s p o r a ) 有所研究表l 是常 見的可降解纖維索的菌種。 插表l 基于木材腐朽類型，可把木腐微生物分為白腐菌( w h i t e - r o tf u n g i ) 、褐腐菌 ( b r o w n - r o tf u n g i ) 和軟腐菌( s o f t - r o tf u n g i ) 三類，白腐菌是研究最多、最為深入的 一類降解木索的微生物，它具有完整的木素降解酶系，能將木素徹底分解為c 0 2 ； 而褐腐菌分解木素的能力很差，普遍認為脫甲基是褐腐菌對木素的主要修飾反 應(yīng)；軟腐菌部分分解或修飾木素，其降解木素的能力介于白腐菌和褐腐菌之間。 放線菌降解木素研究以鏈霉菌( s t r e p t o m y c e s 警) 進行的較多與大數(shù)白腐菌不同， 鏈霉菌降解術(shù)素活性是在初級代謝階段通過脫甲基、芳環(huán)斷裂和側(cè)鏈氧化降解 木素。其它細菌如假單孢桿菌( p s e u d o m o n a ss p ) 、芽孢桿菌( b a c i l l u ss p ) 和梭菌 ( c l o s t r i d i u ms p 1 等也有降解木素能力，細菌降解術(shù)素以溶解木素作用為主，使木 素礦化成為c 0 2 的能力遠低于自腐菌 堅塑型墼l 蕉= 莖 表1 1 ：降解纖維素的部分微生物類群 乃, i c h o d e r m ar e e s e l p 沁m i l a e i e z 蛐 國伊舯脅 z 砌帕d 鋤p 伽鋤。m m z 酗e 塒o b i 嘲耐 l e 訊u mm i i i l ，”?！啊?舶扛d p 泗缸” 1 1 | l 鄹。 p y r i c 出口r 腳 i i o n g i b r a c h i a t w z n c o r i o k m 的h p e 哦蛐m c i t r i n u m f 鰳| 溉啦 p 硒t c 叫o s ” n c o t 口噸 p i 他m 拈p l e o s 帆“嘶 p j a n t h i n e l l “n p b 8 1 m 附畹e 池h m 只n o t a t u m p h “m 口h i k m i p 岫如6 池 m 口r h m 班細研e p 聊毗”嘞螂m 懶 血p e 嚼t 沁h 妒 枷婦d mw r i 口 爿舅w 塒 一f o e t i d u s b a c t c h 8 爿i “扣船 c l o u s t r i d u m 船f 0 6 硼m a - o r ) , z a e c | 袖栽i a _ s a n 鋤 c ? t 口n 麝l d 。帆吼 。+ 彳- 刪婦 c 聃e 池m 一塒 c 挑m 鯽螂 a a c u l e a l u s c ? l h 哪h e | | 證e u m n e u r o s p o r ac r a s s a e 肼m 矗 丑m 4 i c o 蛔i 瑙o i e 覦3 p s e 塒m m 腳他s c 儲 m y r o t h e c i u mv e r r t o r i a h m i n 。c - c o l b m a c ”o p h o m i n a p h a z e o l i n a a 批神缸 e 船 - 4 山東大學(xué)碩士學(xué)位論文 第一章 1 3 纖維索生物降解的機理 1 3 1 纖維素酶解機制 自從1 9 0 6 年從蝸牛消化液中發(fā)現(xiàn)纖維素酶以來，人們對纖維素的酶解進行 了大量的研究。從化學(xué)反應(yīng)看，纖維素的降解只涉及1 3 1 , 4 - 糖苷鍵的水解及氫鍵 的斷裂，是一個簡單的反應(yīng)過程，但作為植物細胞結(jié)構(gòu)材料的纖維索是由纖維二 糖單元組成的螺條形的糖鏈，借氫鍵或其他共價鍵相互作用定向平行排列和堆砌 而成的惰性高聚物。纖維索底物結(jié)構(gòu)的高度復(fù)雜性以及酶組分的多樣性為徹底了 解纖維素降解機制帶來一定的困難。 1 9 5 0 年r e e s e 等1 5 提出了著名的c 1 c x 假說，認為c l 因子首先破壞纖維素 結(jié)晶區(qū)鏈間的氫鍵，然后在c x 和葡萄糖苷酶的作用下徹底水解。c l 因子好比氫 鍵酶的作用。1 9 6 9 年e r i k s s o n l 6 提出了順序作用的c x c l 假說。c x 酶隨機水解 纖維素鏈的糖苷鍵，生成還原性和非還原性末端緊接著c i 酶從非還原性末端 水解產(chǎn)生纖維二糖。由于這一機制在當(dāng)時較好地解釋了c l 和c x 的協(xié)同作用且后 來得到了實驗驗證，逐漸發(fā)展成為現(xiàn)普遍認可的外切酶一內(nèi)切酶的協(xié)同作用機制， c l 被確定為外切纖維素酶1 7 現(xiàn)普遍認為真菌降解纖維素酶系由以下三種酶組成，三種酶組分協(xié)同作用完 成對纖維素的徹底降解。 1 內(nèi)切葡聚糖酶( e n d o - g l u c a n a s e ) 。隨機水解纖維素鏈內(nèi)的1 3 1 。4 葡萄糖苷 鍵： 2 外切葡聚糖纖維二糖水解酶( 外切酶，c e l l o b i o h y d r o l a s e s 簡稱c b h ) ，從 纖維素的非還原性末端水解釋放纖維二糖； 3 1 3 葡萄糖苷酶( 1 3 1 , 4 - g l u c o s i d a s e ) ，水解纖維二糖生成葡萄糖。 雖然上述機制基本可以解釋外切酶內(nèi)切酶的協(xié)同作用，但仍存在一些難以 解釋的問題如為什么酶組分之間存在協(xié)同作用的差異性? 不同纖維素酶組分的 底物特異性如何解釋? 尤其是無法說明這種協(xié)同作用的起始反應(yīng)是如何進行的， 特別是對天然纖維素結(jié)晶區(qū)的酶解機制沒有搞清楚。自8 0 年代末，隨著分子生 物學(xué)和現(xiàn)代實驗技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。對纖維素的酶解機制以及酶的結(jié)構(gòu)和功能的 研究取得了突破性認識。1 9 8 6 年，n l b r g h 埔用木瓜蛋白酶水解t r e e s e i 的c b h l ，得到了具有吸附結(jié)晶纖維素能力的吸附結(jié)構(gòu)域( c e l l u l o s eb i n d i n g 山東大學(xué)頸士學(xué)位論文第一章 d o m a i n ，c b d ) 和具有催化( 水解) 能力核心蛋白區(qū)，即c d 區(qū)( c a t a l y t i c d o m a i n ) 。 研究發(fā)現(xiàn)c b hi 失去c b d 區(qū)后，對結(jié)晶纖維素的吸附和水解能力大部分喪失， 僵對菲結(jié)晶區(qū)的吸附和水解能力基本未變挎，對rr e e s e i , c f i m i 及c e l l u l o m o n a s 的c b h i 的c b d 進行定點突變的研究結(jié)果也證實了這點2 0 引。k n o w l e s 等人 認為c b d 具有“疏解”纖維素鏈的作用2 1 。我實驗室對擬康氏木霉z p s e u d o k o n i n g i i 和徽紫青霉的c b hi 的c b d 的研究也獲得類似結(jié)果。并進一步 觀察到c b d 吸附于纖維素后會導(dǎo)致纖維素超分子結(jié)構(gòu)的破壞，但不伴有還原糖 的產(chǎn)生，即纖維索內(nèi)的糖苷鍵未發(fā)生水解2 2 、2 4 = 這一發(fā)現(xiàn)為徹底搞清結(jié)晶纖維素 的起始降解杌制提供了重要依據(jù)；同時也引發(fā)出一個問題即纖維素超分子結(jié)構(gòu) 的變化是否是降解的起始? 1 3 2 氧化機制 雖然上述酶解機制已得到認可，但幾十年來，人們利用纖維素降解酶系離體 降解纖維素的轉(zhuǎn)化效率一直較低，這也成為紆維素酶應(yīng)用中的一個障礙。是否除 了酶解機制外，還有其它的因子或機制參與纖維素的降解? 最初發(fā)現(xiàn)氧化作用的 參與是1 9 7 4 年。e r i k s s o n2 5 發(fā)現(xiàn)氧氣可以提高白腐菌pc h r y s o s p o r i u m 對纖維素 的降解速度。于是猜測是否有氧化酶參與降解。周年，w e s t e r m a x k 和e r i k s s o n 從pc h r y s o s p o r i u m 中分到了纖維二糖脫氫酶( c d h 嚴(yán)弱；1 9 7 7 年。a n d e r 和 e r i k s s o n 2 7 又從其他六株白腐菌中分到了c d h ，到目前為止，已從多株木材降解 菌中發(fā)現(xiàn)了c d h 的存在”，我室也撂到了類似的實驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在產(chǎn)生c d h 的微生物中可能存在著纖維素降解的氧化機制2 5 01 9 9 2 年，k r c m o r 和w & x t 2 9 發(fā) 現(xiàn)c d h 對纖維索的影響與氧氣的消耗有著直接的聯(lián)系，且發(fā)現(xiàn)c d h 可以還原 f e 3 + 為f e 2 + 并以纖維二糖為電子供體還原。2 產(chǎn)生竭0 2 ，以f e n t o n 反應(yīng)的形式 產(chǎn)生羥基自由基h o 。，h e n r i k s s o n 更進步提出了c d h 以產(chǎn)生的h o 氧化 解聚纖維素的觀點3 0 ，此后又有一些研究表明c d h 產(chǎn)生的h o 能破壞結(jié)晶纖 維索的緊密結(jié)構(gòu)，在降解中起著重要的作用3 h 3 。 雖然c d h 在纖維素降解中的氧化機制是近十年討論的一個熱點，但實際上 關(guān)于h o 氧化作用纖維素的觀點早在1 9 6 5 年就已提出，h a l l i w e l l 發(fā)現(xiàn)f e n t o n 試劑h 2 g b f + 產(chǎn)生的h o 具有極強的纖維素降解能力，h 2 0 2 + f + 一h o 山東大學(xué)磺士學(xué)位論文 第一章 + o h - + f 礦，遴提出了h o 。氧化降解纖維素的假說。木材降解菌的一大類群 一褐腐菌降解纖維索機制的研究更使研究者們認識到h o 氧化機制在纖維索 降解中存在的可能性和重要性。褐腐菌不具有對于水解纖維素結(jié)晶區(qū)至關(guān)重要的 外切纖維索酶，卻能完成對纖維索的徹底降解。迄今已從多株褐腐菌中分離到能 介導(dǎo)h o 。生成的小分子物質(zhì)，對纖維素的作用實驗表明h o 。確實在纖維素的 降解初期起著重要的作用3 5 。 除上述之外近來還有關(guān)于短纖維形成因子的報道。早在六、七十年代， h a l l i w e u 就曾報道過短纖維形成現(xiàn)象m3 6 ，認為短纖維的形成是纖維素降解的起 始。1 9 8 4 年，g r i f j 曼n ”從? = r e e s e i 菌的商品酶中分離得到一個能將濾紙裂解為短 纖維的非酶因予，與底物作用時體系中無可溶性還原糖的產(chǎn)生；此后對多株木材 降解菌的研究，更是證實了此種短纖維形成因子存在的可能性和與纖維素酶組分 的不同囂。雖然短纖維形成因子的作用機制還未確證，但從其作用特點看，極有 可能是氧化機制在起作用 1 4 褐腐真菌降解木質(zhì)纖維素的研究 1 4 1 研究進展 長期以來，關(guān)于纖維素降解機制的研究主要集中在木霉等絲狀真菌的內(nèi)、外 纖維素酶怎樣催化纖維素分子鏈b 葡萄糖苷鍵的水解作用方面，已深入到分子 水平?，F(xiàn)已基本搞漬了它們水解結(jié)晶纖維素的機制，但研究大都是以不臺木素的 纖維素材料進行的，仍未能闡明天然本質(zhì)纖維素難以被降解的原因。在天然木質(zhì) 纖維材料中，由于半纖維素和木紊與纖維索圊緊緊相連，特黜是木素包被著纖維， 纖維素酶無法與纖維接觸，酶水解作用不能進行，這是木質(zhì)纖維材料利用中的最 大障礙。雖然木素可被自腐蓖等微生物徹底降解，但降解機理沒有摘清，依靠木 素降解途徑來解決天然木纖材料中纖維利用的研究也受阻。為擺脫上述困境，研 究者們一直在探索新的降解途徑。近年來，褐腐萄園其降解木材的強大能力、降 解方式的獨特性而各受關(guān)注，其降解纖維素機制的研究成為國際上研究和爭論的 一個熱點。 山東大學(xué)碩士學(xué)位論文第一章 1 4 2 褐腐菌降解木材纖維素的特點 褐腐菌是降解木材能力極強的一類擔(dān)子菌，可在木素少量被修飾或降解的情 況下徹底降解木材，造成纖維素和半纖維素迅速解聚。研究發(fā)現(xiàn)此類菌在降解纖 維素時有許多獨特的地方。 1 褐腐菌雖然大量降解木材，但在生長前期，只造成纖維素聚合度大幅度降低， 卻不引起失重3 9 ： 2 其次盡管褐腐菌降解纖維素能力極強，它的纖維素酶系卻不完整3 9 。真菌 纖維素降解酶系一般由外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶和b 葡萄糖苷酶組成， 三者互相協(xié)同完成對纖維素的降解而褐腐菌不具有對水解結(jié)晶區(qū)至關(guān)重要 的外切葡聚糖酶： 3 褐腐菌降解木材時，植物細胞壁的s 2 層先被降解，而緊貼菌絲的s 3 層卻保 持完整4 0 。 1 4 3h o 氧化降解纖維索機制 鑒于上述降解天然纖維素的特點，研究者們推測褐腐菌可能存在一種獨特的 木材降解體系。起初。研究思路集中在尋找一種未知的小分子的酶，預(yù)想此酶能 穿入木材細胞壁中，降低纖維素的聚合度。但在過去4 0 年的研究中，對褐腐菌 的胞外物質(zhì)進行了大量的分析，但未找到這樣一種酶。對木材細胞壁的孔徑大小 研究表明，酶分子不能穿過完整的木材細胞壁4 l 哪；另有免疫電子顯微鏡觀察發(fā) 現(xiàn)褐腐菌的胞外降解酶類和代謝物包括各種纖維素酶等在早期降解階段，都不 能進入到木材細胞壁中“堋。1 9 6 5 年，h a l l i w e l l 發(fā)現(xiàn)f e n t o n 試劑h 2 0 卯e 2 + 產(chǎn) 生的h o 具有極強的纖維索降解能力3 4 。 h 2 0 ：+ f e e + 一h o + o h + f 礦 推測在天然纖維素的降解中可能存在非酶的氧化機制。關(guān)于非酶機制的最有力 的證據(jù)是1 9 8 1 年c o b b 所做的實驗。他將纖維素底物進行同位素標(biāo)記，將底物 與活菌體用能阻擋酶組分濾過的超濾膜分隔開，但還是檢測到了帶有同位素標(biāo)記 的可溶性產(chǎn)物，表明褐腐菌有非酶的小分子組分參與了纖維素的降解。k o e n i g s 等人也發(fā)現(xiàn)經(jīng)f e n t o n 試劑作用過的木材在物理化學(xué)性質(zhì)上與褐腐的木材是相似 的掘4 7 ，后經(jīng)紅外光譜、g c m s 分析表明，纖維素經(jīng)f e n t o n 試劑h 2 0 , r f e 2 + 作 山東大學(xué)頸士學(xué)位論文第一章 用和纖維素經(jīng)褐腐菌作用的產(chǎn)物是一致的。并在一些褐腐菌如g i o e o p h y l l u m t r a b e u m 中通過測定k t b a ( 2 k e t o - 4 - t h i o m e t h y l b u t y r i ca c i d ) 被h o 氧化產(chǎn)生 的乙烯間接檢測到了h o 生成挑4 9 ，褐腐菌以h o 氧化降解纖維素的假說 日漸形成。 此外，褐腐菌具有鐵絡(luò)合能力也是一個重要發(fā)現(xiàn)。木材中鐵的含量通常是 很低的，為o 2 um o l l ，而可溶性鐵更低一些。f e n t o n 反應(yīng)需要r p 的參與， f e k e t e 和j e l l i s o n 等人利用c a s 檢測方法首次由褐腐菌中檢測和分離得到了具有 鐵絡(luò)合能力的絡(luò)合物5 0 5 1 , 這為褐腐菌的依賴于f e 2 + 的h o 氧化機制提供了證 據(jù)。 褐腐菌的氧化降解機制提出及發(fā)現(xiàn)其具有鐵絡(luò)合能力以后，研究工作集中在 尋找含小分子物質(zhì)的胞外氧化降解體系，其中體系中參與單電子氧化還原反應(yīng)、 具有鐵絡(luò)合能力的小分子物質(zhì)的分離純化及其在纖維素降解中的作用機制是研 究的焦點由于密粘褶菌g l o e o p h y l l u mt r a b e u m 的纖維素降解能力很強，棠被作 為褐腐菌的代表菌株進行研究。但因?qū)ふ疫@樣一種未知因子有一定的難度，且檢 測其活性的方法與水解酶類也很不相同，因此研究工作一直未有大的突破，進展 較為緩慢。 1 9 9 2 年，e n o k i 等人引從g t r a b e u m 以木質(zhì)纖維素為底物的胞外培養(yǎng)液中分 離得到了一個部分純化的組分，含f c 2 + 、蛋白質(zhì)、和中性碳水化合物，凝膠過濾 層析測得其分子量在1 0 0 0 5 0 0 0 ，此組分可催化單電子供體如n a d h 與0 2 形 成h 2 0 2 ；而且此組分可將f e 3 + 還原為f c 2 + ，并具有鐵絡(luò)合能力，實驗證明為含 糖的小肽。但此后十年再也沒有關(guān)于糖肽研究的詳盡的報道，已公開發(fā)表的研究 工作也只限于分離純化方面，這種小分子物質(zhì)在纖維紊氧化降解中的作用未有闡 述。 近來，關(guān)于褐腐真菌纖維素氧化降解體系中小分子物質(zhì)為鐵離子絡(luò)合物的報 道較多。1 9 8 9 年，f e k e t e 等人發(fā)現(xiàn)多種褐腐菌可產(chǎn)生高度絡(luò)合鐵的物質(zhì)稱為 s i d e r o p h o r e s o ，木材降解菌產(chǎn)生的s i d e r o p h o r e s 一般是類酚結(jié)構(gòu)的化合物。1 9 9 1 年，j e l l i s o n 首次從g t r a b e u m 的培養(yǎng)液中用薄層層析的方法分離得到具有高度 絡(luò)合鐵離子能力的物質(zhì)強，后經(jīng)i - i p l c 、g c - m s 、紅外光譜檢測鑒定為酚類物質(zhì)， 進一步研究發(fā)現(xiàn)酚類化合物可以還原f e 3 + ，產(chǎn)生h o ，對纖維紊底物具有一定 山東太學(xué)頸士學(xué)位論文 第一章 的作用。g o o d e l l 等人將此類由g t r a b e u m 產(chǎn)生的、經(jīng)1 0 0 0d a 的膜超濾過并 經(jīng)乙酸乙酯抽提出的具有鐵絡(luò)合能力的酚類物質(zhì)稱為g tf a c t o p 5 目前關(guān)于q f a c t o r 的報道均來自于g o o d e l l 研究小組”。 z o h a r 鉗也曾報道g t r a b e u m 的胞外培養(yǎng)液經(jīng)截留分予量 1 0 0 0 的膜超濾后 經(jīng)船l c 分離，得到一純化的小分子組分，鑒定為2 ，s 二甲氧基1 4 一苯醌，可將 f e ”還原為f e ”，且可自我氧化產(chǎn)生h 2 0 2 。能強烈斷裂與纖維素一樣由c c - 構(gòu) 成的聚乙烯乙二醇，推測gf r a b e u m 利用這種氫醌驅(qū)動的f e n t o n 反應(yīng)裂解纖維 素，氫醌在i - i ：0 2 和f e 2 + 的循環(huán)生成中起重要作用。k e n n e t h 及a n d r z e j 等人5 5 兩 也有類似的報道。 關(guān)于多株褐腐菌降解纖維索特性研究主要有h i g h l e y 和e n o k i 等人的工作。 h i g h l e y 通過對多株褐腐菌作用后的纖維索底物進行分析發(fā)現(xiàn)，在纖維素降解初 期，纖維素迅速解聚，解聚與底物大量失重是兩個獨立的過程；e n o k i 等人則發(fā) 現(xiàn)多株褐腐菌的粗酶液所具有的單電子氧化活性似乎與底物的降解有關(guān)系。但兩 人的研究都沒有分離純化工作作基礎(chǔ)，都是胞外粗酶液作用的結(jié)果分析。本實驗 室的王蔚等人以褐腐菌的典型代表菌株一密粘褶菌g l o e o p h y l l u mt r a b e u m 為研究 對象，于其胞外酶液中首次分離純化得到低分子量的活性多肽組分( 稱作q 因子) ，研究了g t 因子介導(dǎo)的羥基自由基h o 的形成機制及其在木質(zhì)纖維素降 解中的作用。電子自旋共振s r ) 、紅外光譜( f t - i r ) 、x 光衍射等分析證實q 因 子可介導(dǎo)h o 的生成且以h o 。破壞纖維素中的氫鍵連接并導(dǎo)致糟苷鍵的斷 裂，使其暴露出更多的還原性和非還原性末端，為纖維素的迸一步降解提供條件。 為研究褐腐菌中h o 氧化降解纖維素機制的確立提供了直接的證據(jù)5 7 堋。 1 4 4 目前研究中存在的問題 由近年來的研究進展可知，關(guān)于褐腐菌降解木質(zhì)纖維素的研究已基本建立起 來的結(jié)論是：褐腐菌可能以一種非酶的、小分子物質(zhì)參與的、涉及i i o 的氧 化機制來降解纖維素。雖然現(xiàn)普遍認為褐腐菌以h o 機制氧化降解纖維素，但 由于缺少諸多直接的、確鑿的證據(jù)，h o 氧化降解機制的確立還需要進一步的 研究。 山東大學(xué)硬士學(xué)位論文第一章 e n o k i 的糖肽以及g o o d e l l 的g tc h e l a t o r 都是由密粘褶菌分得的，是否存在 于其他褐腐菌未曾考證；此外，g t c h e l a t o r 是從以葡萄糖為碳源的g l o e o p h y l l u m t r a b e u m 的液體發(fā)酵液中分到的。許多研究已表明在自然環(huán)境中，真菌以木纖材 料為底物的固體發(fā)酵的降解酶系與以葡萄糖等為碳源的液體發(fā)酵的降解酶系是 根本不同的6 1 6 3 | 且酚、醌類物質(zhì)為次級代謝產(chǎn)物，是木素降解的中間體。褐腐 菌在降解木質(zhì)纖維素的初期基本不降解木素，所以醌類物質(zhì)為降解初期的小分子 活性物質(zhì)的可能性不大。 雖然關(guān)于揭腐菌的研究已有幾十年，關(guān)于褐腐菌降解木質(zhì)纖維素的研究大多 是以一種菌一密粘褶菌g l o e o p h y l l u mt r a b e u m 為模型進行研究的，因此大多數(shù)結(jié) 論的得出也是基于一種菌的研究，未免存在片面性，研究結(jié)論是否適用于其他褐 腐菌未曾考證，還未有人對多株褐腐菌進行系統(tǒng)的研究，這其中也包括分離純化 工作的片面性。近來，關(guān)于褐腐菌胞外低分子量活性物質(zhì)分離的研究較多，但此 類物質(zhì)是否廣泛產(chǎn)生。h o 氧化降解纖維素的特點是否具有普適性，還需要多 株褐腐菌研究結(jié)果的支持。 本文在第二章中對褐腐真菌降解纖維素的特性進行了普遍研究，證明了褐腐 真菌在木纖材料上生長時，普遍產(chǎn)生具有h o ?；钚缘牡头肿恿康奈镔|(zhì) 1 - 5 褐腐真菌產(chǎn)生的鐵螯合物在纖維素降解可能的機制分析 褐腐真菌降解纖維素機理的研究主要是建立在1 9 6 5 年h a l l i w c l l 提出的假 說，即由于f e n t o n 試劑h 2 0 2 f e 2 + 產(chǎn)生的h o 具有極強的纖維素降解能力”， 繼而推測在天然纖維素的降解中可能存在羥自由基相關(guān)的非酶的氧化機制到目 前為止，越來越多的研究證明了這種氧化機制的存在及其在羥自由基在纖維素降 解中的作用 值得注意的是，在褐腐菌的氧化降解纖維素的體系中，鐵離子 在羥自由基產(chǎn)生體系和纖維紊降解過程中起著至關(guān)重要的作用，另外，它還是重 要的氧載體和電子傳遞體。影響著生物體的物質(zhì)代謝和能量代謝。本實驗室王蔚 等的研究表明，吼因子不但具有產(chǎn)羥自由基的活性，還具有螯合鐵離子的活性。 隨著研究的深入，我們發(fā)現(xiàn)凝膠過濾層析中。聱合鐵活性組分與g t 因子話性部 分不是完全重合的，更重要的是能產(chǎn)生羥自由基的物質(zhì)非常多，而且目前羥自 由基常用的簡便檢測方法的特異性較差。為了更好的研究褐腐菌的氧化降解體 山東大學(xué)碩士學(xué)位論文第一章 系。我們把研究的重點轉(zhuǎn)向了這種螯合鐵活性組分。 環(huán)境科學(xué)的研究表明“。一些鐵有機配體化合物具有光化學(xué)活性，如鐵草酸 配合物，鐵檸檬酸、甲酸、酒石酸配合物，鐵硬脂酸鹽等。其中一些化合物的 光活性被利用來降解有機物。一些作者還報道了草酸鐵與光- f e n t o n 試劑結(jié)合降 解全氯烴及實際廢水中的有機污染物。有報道說鐵硬脂酸鹽可來降解大分子有 機聚合物，如塑料包裝袋等。鐵有機配合物為什么能降解有機化合物甚至是大分 子有機化合物呢? z u 0 6 5 6 7 等人的研究表明，鐵草酸鹽絡(luò)合物的光解是大氣水相 中h 2 0 2 的主要來源。大氣水相中。鐵草酸鹽絡(luò)合物作為一種催化劑，在溶解氧 體系中，經(jīng)紫外光或可見光的照射可以通過一系列的自由基反應(yīng)發(fā)生光解反應(yīng)， 產(chǎn)生h 2 0 2 h 2 0 2 通過f e n t o n 反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基，后者可以氧化多種天然或人工的 有機物或者無機物，具有相當(dāng)重要的意義。這就為鐵螯合物在纖維素降解機制中 的作用研究提供了嶄新的思路。褐腐菌是否就是通過這種低分子量的鐵螯合活性 物質(zhì)和鐵共同的催化作用使水相中產(chǎn)生h 2 0 2 ，繼而產(chǎn)生一系列自由基反應(yīng)來 達到其輔助降解纖維素的作用昵? 本文的第三章就把研究重點放在褐腐菌產(chǎn)生 的鐵螯合物上，進行了一系列研究。對褐腐菌產(chǎn)生的這種具有輔助降解纖維素作 用的鐵螯合物進行了一系列分離純化的嘗試，對其結(jié)構(gòu)特征進行了分析。 下面簡要介紹一下鐵螯合物相關(guān)的研究現(xiàn)狀。 1 6 鐵螯合物的多樣性 鐵是一種地球上含量豐富的金屬元素，主要以不溶性的f e 3 + 形式存在，p h 7 時的溶解度僅為l f f 3 m o f l 醴。一般生物利用鐵都是通過一些螯合鐵的組分把這種 低濃度的鐵進行富集或者把不能利用的鐵轉(zhuǎn)化為可利用的形式h o p p i n g ( 1 9 6 3 ) 研究認為鐵是以螯合物的形式被吸收的。在動物的腸腔內(nèi)，無論是f e 2 + 還是f e 3 + ， 都必須與內(nèi)源或外源配位體結(jié)合形成絡(luò)合物，再以此形式吸收并進一步轉(zhuǎn)運從 另外角度講。細胞膜是由蛋白質(zhì)和脂類組成的，它是細胞內(nèi)外環(huán)境的天然屏障， 鐵離子要穿過細胞膜。需要種載體分子將之包被起來，形成一種有機的脂溶性 表面，才能穿過細胞膜?？梢?，鐵螯合物在比較原始的微生物類群中起著重要的 作用，在高等動植物甚至是人的代謝中也起著非常重要的作用。 山東大學(xué)碩士學(xué)位論文第一牽 下面首先介紹一下鐵螯合物相關(guān)的概念和研究背景。 i 6 1 鐵螯合物相關(guān)概念 鐵螯合物( i r o nc h e l a t o r ) 是指生物為了利用鐵元素或者其他代謝需要所產(chǎn)生 的一類重要的能夠螯合鐵的生物活性分子。能夠?qū)﹁F有螯合作用的物質(zhì)很多，它 們是生物利用鐵元素的一種重要的分子。其中，鐵載體( s i d e r o p h o r e s ；i r o n c a r r i e r s ) 是一種非常重要的鐵螯合物。它是指細菌或真菌在缺鐵壓力下產(chǎn)生的一種分子量 相對比較低的鐵離子的特異性螯合物的。本文研究的褐腐菌產(chǎn)生的鐵整合物大致 可以歸為鐵載體這一類生物活性物質(zhì)。 這些化合物對微生物的作用是在環(huán)境中獲取鐵或者使這些礦物質(zhì)變得可用。 相關(guān)的研究已經(jīng)有五十多年的歷史。其中比較有趣的是大多數(shù)好氧和兼性好氧微 生物至少產(chǎn)生一種鐵載體。鐵載體與微生物對動物和植物的毒性有關(guān)，現(xiàn)在有較 好的i 晦床應(yīng)用的前景，并在農(nóng)業(yè)中有起著很重要的作用。 1 6 2 產(chǎn)生鐵螯合物微生物的多樣性 目前報道的能產(chǎn)生鐵螯合物的微生物很多在真菌和細菌中都有報道。 m i l a g r e s 等用改良的絡(luò)天青s ( c a s ) 瓊脂糖平板方法從多株真菌( 擔(dān)子菌、 半知菌予囊菌、接合菌) 和細菌( 革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌) 中檢測到了 鐵螯合物活性，證明了鐵螫合物的廣泛存在。特別地，一些具有木材降解功能的 擔(dān)子菌和益霉的c a s 反應(yīng)最迅速。 熒光假單胞菌群( f l u o r e s c e n t p s e u d o m o n a d s ) 在l b 培養(yǎng)基上可以產(chǎn)生一種 黃綠色色素，大量的研究已經(jīng)確證這種色素就是一種鐵載體產(chǎn)生鐵載體的菌株 表現(xiàn)為在菌苔周圍形成橙紅色暈瞬，檢測結(jié)果十分直觀7 1 。 m a c r e l l i s 等對海水里的鐵螯合物進行了富集分離，6 3 的鐵整合物分子量在 特定的分子量范圍內(nèi)( 3 0 0 1 0 0 0d a ) 。而且發(fā)現(xiàn)所有的整合物都具有兒茶酚和 氧肟酸基團證明了海水中的鐵載體與實驗室分離到的鐵載體類型是一致的，這 一結(jié)果的重要性在于對人們理解整個自然界中鐵螯合物的性質(zhì)有很大的幫助8 。 m i l a g r e s 等還從白腐菌中檢測的明顯的兒茶酚類、氧肟酸衍生物和草酸三種 山東大學(xué)碩士學(xué)位論文第一章 鐵螯合活性。并認為在過氧化氫存在的條件下。這些螯合物就可能通過f e n t o n 反 應(yīng)產(chǎn)生自由基的方式對纖維素和半纖維素進行攻擊而降解纖維素并得到和褐腐 菌降解顯微素類似的結(jié)果。另外，他還研究了這種鐵整合物在造紙制漿漂白中的 作用7 3 。 促進植物生長的根際細菌( p l a n tg r o w t h p r o m o t i n gr h i z o b a c t 盯i a , p g p r ) 通 過多種直接或間接的代謝機帝j 抑制病原菌的繁殖并促進植物的生長。在低鐵的環(huán) 境中，p g p r 主要的抑菌機制是分泌一類與鐵高親和( k d = l o 2 0 l f f s 0 ) 的鐵載 體，分子量約為4 0 0 1 0 0 0 d a ，并以特異的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)轉(zhuǎn)移至體內(nèi)供微生物自身 生長的需要，同時，降低了環(huán)境中的鐵濃度使植物病原真菌生長受到抑制。在 土壤中。大多數(shù)植物根系與植物病原真菌相比，能在鐵濃度低1 0 0 0 倍的條件下 正常生長。所以，p g p r 引起的局部缺鐵不會損害植物的正常生長秘。 1 6 3 鐵螯合物結(jié)構(gòu)的多樣性 早期的研究認為：鐵載體型螯合物可以分為兩大類：兒茶酚型衍生物和氧肟 酸型衍生物隨著研究的深入，越來越多結(jié)構(gòu)類型的鐵載體被發(fā)現(xiàn)后來兒茶酚 型衍生物、氧肟酸型衍生物和二羥基苯甲酸鹽型衍生物被認為是三種常見的鐵載 體類型。螯合物分離過程中鐵的存在使鐵螫合物結(jié)構(gòu)的確定變得困難，這是因為 一方面鐵會使結(jié)構(gòu)單元遭到氧化破壞另一方面其順磁性會干擾核磁共振對其結(jié) 構(gòu)的測定明。然而，還是有很多新的結(jié)構(gòu)類型的鐵螯合物被發(fā)現(xiàn)：肽類、羥基喹 啉、有機酸、氨基酸等類型的鐵載體類型化合物都有報道。 p a u l e r e 等用乙醇和反相高效液相的方法從假單胞菌細胞膜