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1 1 1 果蠅染色體果蠅染色體 1 2 識別標記識別標記 1 3 命名命名 1 4 什么使果蠅如此偉大 平衡染色體什么使果蠅如此偉大 平衡染色體 1 5 解密交配方案解密交配方案 1 6 基本果蠅管理基本果蠅管理 1 7 精心于難養(yǎng)品系精心于難養(yǎng)品系 1 8 為雜交收集果蠅為雜交收集果蠅 第一章第一章 遺傳雜交的基礎知識遺傳雜交的基礎知識 在過去的 85 年里 果蠅遺傳學已經發(fā)展成為一門藝術 這部分是由于時 間和信息積累的結果 更多是一些新的遺傳學工具和一些果蠅生物學本身特征 的結果 凈效果是使雜交方案更可靠 減少了減數分裂重組中的隨機性 同時 基因在染色體上的物理位置也更容易確定 以下幾節(jié)介紹一些果蠅遺傳學的基 本知識和如何飼養(yǎng)果蠅以及果蠅的命名 1 1 果蠅染色體果蠅染色體 果蠅有四條染色體 通常用直線和圓圈來分別代表染色體臂和著絲粒 L 代表左臂 R 代表右臂 X 和第四條染色體有較長的左臂和很短的 右臂 一般不畫出來 X 2L 2R 3L 3R 大小基本相當 而第四染色體 則只有它們的 1 5長 果蠅的性別決定是基于 X 染色體和一套常染色體的比率 雄蠅中一條 X 和兩套常染色體的比例是 0 5 而雌蠅的比例為 1 Y 染色體上只有幾個基 因 除了影響精子正?；顒幽芰ν?對雄蠅發(fā)育的很多方面是沒有必要的 2 果蠅遺傳學的一個重要特征是雄蠅中完全沒有重組現(xiàn)象 盡管重組在別的 物種的異配性別中常常會低些 但果蠅卻為 0 可是染色體重組在雌性果蠅中 卻是正常存在的 不過它可以利用果蠅實驗者最獨特的工具 染色體平衡子來 控制 由射線引起大量斷裂和重接使平衡染色體中整個正常染色體的順序被搞 亂了 在減數分裂前期不能和正常同源染色體配對和重組了 果蠅中的平衡子 可以通過顯性和隱性突變來識別 因此它們從親代到子代的傳遞方向可以很清 楚地分辨出來 由于它們完全不與其同源染色體重組 故其同源染色體的去向 亦可相應地推斷出來 由于同源染色體可靠分離 即使其同源染色體沒有顯性 標識也照樣可以判斷出來 若子代未獲得平衡染色體 則必獲得其同源染色 體 這是果蠅雜交方案中最重要的原理 本章將要詳細討論的平衡子是大量重排 倒置 染色體中的一個特例 其 它將會在以后的討論中出現(xiàn)的重排有 易位 復合染色體 缺失和重復 幾種 主要重排種類列于下 倒置 其中在同一染色體上發(fā)生兩次斷裂和修復事件 導致出現(xiàn)一個倒置 片段 斷點用括號表示 易位 兩條染色體上發(fā)生斷裂和修復 結果是兩個片段發(fā)生交換 復合染色體 兩條左臂或兩條右臂連在同一著絲 缺失 同一條染色體上發(fā)生兩次斷裂 修復時除去了中間片段 重復 切除的片段插入到另一條染色體上形成雙份 果蠅的另一個重要特征是唾液腺中的多線染色體 其上有高分辨的帶狀圖 案 早些時候 人們將基因的作圖位置和染色體的物理特征聯(lián)系起來 并確定 3 染色體重排的斷點位置 在分子時代 它們有助于克隆序列的物理定位 每條 主染色體臂分為 20 個編號的片段 X 為 1 20 2L 為 21 40 2R 為 41 60 3L 為 61 80 3R 為 81 100 第 4 條染色體為 101 104 每一片段又按字母順序分 為幾個區(qū) 每個字母編號的區(qū)再分為數字編號的帶 1 2 識別標記識別標記 帶有標記的突變體是解釋基因型的關鍵 有時它們用于標記你所想要研究 的那條染色體 但它們更多的是標記你想丟掉的那條染色體 大批突變體影響 眼的顏色 眼的形狀 翅膀形狀 翅膀脈絡 剛毛顏色 剛毛形狀和表皮色素 形成 這幾種主要表型用于標記不同的染色體臂 突變體表型的描述可見于 Lindsley和 Zimm 的書 在本書的插頁中也畫了 一些最常用的標識 只需多看幾眼便可認識 但有關這些標識表達的一致性和 它們之間的相互作用應該牢記 表達的一致性反映了由果蠅突變基因的基因型表現(xiàn)出的表現(xiàn)型的可能性 如果突變基因型表現(xiàn)出一定的表現(xiàn)型 其表現(xiàn)型又將在怎樣一個范圍內表現(xiàn) 用來描述突變的 等級 包含了這些參數 最高的是指極端的一致的狀態(tài) 當 通過標識選擇突變體時 一定程度的不一致性是可以允許的 最壞的情況就是 漏掉一些果蠅 可是當你不想要某一標識的果蠅時 那就危險的多 在這種情 況下 必須嚴格保持基因表現(xiàn)的一致性 至少對那些不一致性心里應該有底 這能幫你分辨出那些標識可能有問題 當你同時使用兩個影響同一性狀的突變標識時 它們之間的相互作用就顯 得十分重要 比如 當使用了兩個都影響剛毛形狀的突變時 搞清楚雙突變是 怎樣的 是否能與單突變體區(qū)分的開是很重要的 這些信息一般在紅皮書中是 找不到的 你要靠自己的經驗了 1 3 命名命名 毛主席語錄 果蠅命名是紙老虎 果蠅遺傳學可以簡化成一些簡單的規(guī)則 下面舉例說明 1 f cn bw TM2 tra 本例說明以下幾點 只有染色體上有某種突變才寫上它的基因型 染色體按 X Y 2 3 4 順序 排列 此例中 f cn bw TM2 tra分別指 X 第 2 第 3染色體 4 果蠅基因型一般用斜體表示 突變體名稱一般不用斜體 盡管有些雜志 至今還這樣做 本書按慣例行事 突變體簡寫一般不超過 3 個字母 f 代表 forked 影響剛毛的形態(tài) cn 代表 cinnabar bw 代表 brown 它們都影響果蠅眼的顏色 共同作用時 形成白眼 TM2 指平衡染色體 third multiple 2 tro 是 transformer 參 與性別決定 小寫字母代表隱性表型 大寫為顯性 基因命名根據酶或蛋白質 例如 Adh 代表乙醇脫氫酶 或根據特殊染色體的重排 平衡染色體 TM2 基因符號間的分號表示不同的染色體 例如 上面提到的基因型分別在 X 第 2 第 3染色體上 重排染色體后面的逗號表示后續(xù)基因也在此染色體上 例如 TM2 的全 稱是 TM2 Ubx 因為它帶一個突變的等位基因 Ultrabithorax 染色體基因型寫成一行表示此基因型是純合型 雜和型則寫成兩行 每 一行對應一條同源染色體 任何未寫明的均表示野生型 因此 f 代表 X 染色體帶有 forked 的等位基 因 X 染色體的其它位點被認為是野生型 雜合時只標出每個染色體的 突變位點 C 1 RM 表示一個復合染色體 C 1 表示是第一染色體的復合染色體 RM 代表著絲粒反向居中 即著絲粒在染色體中間 一條臂與另一條臂 方向相反 即它們用相同的那一端連在著絲粒上 一般記為 X X 或 attached X 這特殊的聯(lián)體是y2 由于聯(lián)體包含兩條同源的 X 染色體連接在同一個著絲點上 它們之間不 會發(fā)生分離 通常 這些果蠅在保存時 雌雄果蠅都帶有 Y 染色體 這 是為了保證所有的雄性果蠅都是可育的 Y 染色體的有無與性別決定 無關 并且對雌性的兩條 X 染色體無影響 但對精子的活動力有影響 由于在雄蠅中 X 和 Y 分離 它們的兒子獲得 Y 染色體的唯一途徑是從 其母處獲得 這樣就保證了所有的果蠅都有 Y染色體 等位基因的純合子 發(fā)現(xiàn)的第二個等位基因 使表 皮顏色為黃色和黑色剛毛 這與y不同 后者具有黃色表皮和剛毛 此種第二染色體基因型雜合體 一個是平衡子 In 2LR O Cy 帶有翹翅 顯性突變 另一條染色體帶有顯性突變 Sco 它沒有胸部的毛 In 2LR 指的是第二條染色體上的左臂和右臂間的倒置 最后一個染色體基因型是指第四染色體 是等位顯性突變的雜合體 對 于這兩個基因的其它等位基因大多是隱性的 這里例外用大寫的上標 D 來表示顯性 而不是按慣例將突變名稱大寫 由于這兩個等位基因是純兩個等位基因是純 合致死的 故所有的果蠅都保持這兩個基因的雜合態(tài) 合致死的 故所有的果蠅都保持這兩個基因的雜合態(tài) 5 染色體重排通過縮寫符號后面跟相關染色體編號和重排名稱來表示 例 如 In 1 sc4 X 染 色 體 上 被 稱 為 scute 4 的 倒 置 由 于 斷 點 在 scute位點上而產生的突變表型 Df 3R P14 第 3染色體右臂部分缺失 P14 代表 Pasadena 14 T 1 4 Bs 1 4 染色體間易位 各有一個斷點和相互重新連接 造成嚴重的棒 眼表型 叫Stone Bs Tp 3 1 ry 35 第三染色體的一個片段轉座到X上 其中一個斷點產生眼顏色突 變表現(xiàn)型 有時稱為易位Tp 3 1 ry35 轉座有時指一個片段從同一染色體一處 移到另一處 當此X染色體在第三對染色體正常的果蠅中存在時 就成為重 復 記為 Dp 3 1 ry35 R 1 WvC C 3L RM h 由第三染色體兩條左臂組成的復合染色體 又稱 attached 3L 它 是突變等位基因 hairy 的純合體 使果蠅頸和頭部多毛 RM 指著絲粒反向居 中 第三染色體的兩條左臂連在同一條染色體上 而非各自通過著絲粒與右臂 相連 Metacentric 指著絲粒在染色體的中間 reveased 指兩條 3L 是通過著絲 環(huán)X 沒有自由末端的X染色體 本例中有白眼基因的異常表達 V variegation C catcheside 6 粒反向相連的 3L 原來的外端仍然在最邊上 這與順序著絲粒居中不同 后者有一個 3末端與著絲粒相連 F 2L 只有第二染色體的游離左臂與著絲粒相連 y Y Y染色體上有一段帶有的野生型等位基因的片段的重復 記作 Tp 1 y y 注意 Y大寫是指染色體 y小寫是指基因位點 1 4 什么使果蠅如此偉大 平衡染色體什么使果蠅如此偉大 平衡染色體 平衡染色體的存在使果蠅與其它生物在遺傳學上有所不同 大多數隱性 突變在雜合狀態(tài)下是看不出來的 果蠅通過雜交顯性基因型能可靠地從其后 代中分辨出來 這給果蠅遺傳學比其它雙倍體生物的操作更容易和有效 H J Muller 最早提出了平衡子這一概念 他還完成了許多果蠅遺傳學的 核心工作 他首先發(fā)現(xiàn)了平衡染色體能抑制染色體交換 并且用它來分離了 新的染色體上的致死基因 從此 多重倒置染色體幾乎不與其同源染色體發(fā) 生交換這一原理就確定了 當這些平衡染色體還攜帶一些突變標識時 它們 在分離分析和定向合成基因型的工作中成為有力的工具 由于這些標記常常 是隱性致死的 這就提供了構建 平衡致死 品系的有效手段 在平衡致死 品系中只有平衡子或致死突變的雜合體才能成活 7 第二和第三染色體上都有許多平衡子 由于第四染色體不發(fā)生交換故不 需要平衡子 最有效的平衡子是能夠抑制整條染色體發(fā)生交換 不能作到這 一點的那些一般有很大一部分的正常序列 所以能偶爾與其同源染色體在隨 后的配對中發(fā)生聯(lián)會和雙交換 這將導致平衡子瓦解 部分被正常序列所替 代 一些標記交換到了同源染色體上 顯然這種情況應該避免 因為它使平 衡子的使用混亂化 由于 X 染色體在雄性果蠅中為半合子狀態(tài) 大部分 X 的平衡子不攜帶 隱性致死基因 相反 有些 X 染色體平衡子帶有隱性雌性不育突變 以防 止品系被 置換 平衡子通常以字母代表染色體 F 代表 X 染色體 S 代表第二染色體 T 代表第三染色體 M 代表多重倒置 還用數字和小寫字母表示系列號 有 時 在起名字后面跟著平衡子所攜帶的主要突變標記的遺傳符號 如下面列 出的大部分平衡子 每條染色體都有不只一種平衡子 X染色體 FM7a In 1FM7 y31d sc8 帶 有 顯 性 突 變 Bar B 隱 性 突 變 yellow y31d scute sc8 white apriccot wa vermilion vOf FM7b 帶有 y 31d sc8 wa和隱性雌性不育基因 lozenge lzsp FM7c 帶有y 31d sc8 wa 和隱性雌性不育基因singed snx2 vermilion vof garnet g4 第二染色體 SM6 real name In 2LR SM6 al2 Cy dp lv1 cn2 sp2 In 2LR O Cy dp 帶有顯性標記Curly 和各種隱形標記dumpy cinnabar speck lv1 cn2 pr 帶 有 顯 性 標 記 Curly 和 隱 形 標 記 dumpy cinnabar speck 第三染色體 TM3 real name In 3LR TM3 y ri Pp sep bx34e TM6 In 3LR TM6 Hn e 其帶有野生型基 因 yellow和隱形標記radius incompletus pink peach sepia bithorax ebony 顯性標記stubble ser 也叫beaded serrate p ssp88 bx34e Ubxp15 TM6B In 3了 R TM6 Hu e 其帶有顯性等位基因 Antennapedia Hu Dichaete D3 Tubby 隱形標記 ebony e 其帶有顯性標記Henna Ultrabithorax 隱形標記spinless bithorax ebony 8 TM8 In 3LR TM8 l 3R DTS th st sb e 其帶有溫度敏感顯性致死 l 3R DTS 其帶有顯性標記 stubble 隱形標記 thread scarlet ebony TM9 是它的派生物 T 2 3 CyO TM9 它是第二和第 三染色體的雙平衡子 是由射線誘導的 在 In 2LR O Cy 和 TM9 之間易位的結果 由于 In 2LR O Cy 部分和 TM9 部分是緊密連鎖的 為了得到整倍體它們都必須存在與同一個合 子中 1 5 解密交配方案解密交配方案 命名后 下一步果蠅遺傳學中最困難的就是交配方案 交配方案是收集所 需的基因型和進行雜交的簡寫 容易使人產生迷惑的一個方面是它不寫出所有 果蠅后代的基因型 只寫出所需要的基因型 如果方案設計正確 象基因型一 樣 果蠅也表現(xiàn)出獨特的表現(xiàn)型 未寫出的假設是同源染色體相互配對并在第 一次減數分裂中彼此分離 在精子和卵子中染色單體是隨機的 受精卵中可能 的二倍體染色體組合也是隨機的 它們是否能存活是另外的問題 我們假設最 初它們是都產生了的 簡圖表示了交配中所涉及的同源染色體的基因型 下面 是一個簡單而典型的例子 此圖表示雄性果蠅 因為其有一條 X 和一條染色體 Y 多只雄性果蠅用 符號表示 與 純合 FM7a 和雙雜合 In 2LR O Cy 帶有顯性標記 Scutoid 的雌性 處女蠅 多只用 表示 果蠅雜交 由于雄性果蠅基因型中未提及第二 三染色體 它們被假設完全沒有遺傳突變的野生型 在論文的方法部 分 這些平衡子將使用其正式名稱 In 1 FM7a 和 In 2LR O Cy 而在實驗室中 可用簡寫形式 本書的大部分例子也采用簡寫 前面已經提到 一些 FM7 帶 有隱性雌性不育突變 這里 FM7a 則不帶此突變 本例可以使用 這個雜交將產生許多不同的后代 這里只顯示了其中一種 X染色體 FM7a 和 nd 雜合第二染色體雜合的 In 2LR O Cy雌蠅 同時 在培養(yǎng)瓶中你也 回發(fā)現(xiàn)其它種果蠅 9 每一種在表型和基因型上是唯一的 FM7a 上的顯性突變 Bar eye 使得帶有 FM7a 的子代果蠅可以清楚地辨認出來 同樣第二染色體 In 2LR O Cy 上的互 不影響的顯形突變 Curly 和 Scutoid 使胸后部的剛毛消失 使得帶有這些 突變的果蠅很容易分辨出來 nd 突變無法肉眼分辨 在雌性雜合體中不影響 表型 Bar 是 X 染色體很好的顯性標記 因為無論在純合還是雜合狀態(tài)都能 成活 并且二者能夠區(qū)分開 雌蠅 B B 比 B 的棒眼更嚴重 雄蠅中 X 染色 體沒有純合子 只有半合子 雄蠅 B Y 的棒眼程度與雌蠅 B B 一樣嚴重 Bar 的生存能力有助于帶有 FM7a 的雄蠅成活 相反 常染色體的平衡子帶的顯性 標記突變不需要在半合子狀態(tài)下能成活 因為第二 三染色體的半合子是致死 的 本方案中未寫出的假設是減數分裂使同源染色體分離 其任何一個子代個 體都只能獲得其中之一 孟得爾的分離律 每一對同源染色體的分離是與 其它染色體不相干的 雜交中親代雄蠅是性染色體的半合子 nd Y 因而會表 現(xiàn)出突變 的性狀 由于 X 和 Y 染色體在減數分裂中配對并分開 使配子產生 兩種基因型 nd 和 Y 親代雌蠅盡管有兩條平衡子和標記突變 但只有第二 染色體是雜合體 因此只能產生兩種可能的配子 FM7a In 2LR O Cy 或 FM7a Sco 這四種配子基因型能形成四種組合 其它染色體的雜合體將增加 配子的可能類型相應地增加子代的類型 如果你懷疑雜交可能產生后代的種類 數 你可以畫一個 方塊 確保你能想到所有的組合可能 比 方塊 更好的辦法是 代數 或分叉法 對多突變基因型更適用 10 最重要的一點是確保你要的基因型具有獨特的表現(xiàn)型 并能與所有其它后 代區(qū)分開 這是果蠅遺傳學的關鍵所在 1 6 基本果蠅管理基本果蠅管理 幸運的是 對于大多數搞果蠅的人來說 不需要更多的技巧 需要的是 留心 而不是手工技巧 果蠅遺傳學最大的優(yōu)勢在于能做各種雜交 并且每 一種可能的基因型都可以在子代中準確無誤地分辨出來 為了確保這一點 必須保證子代果蠅是通過你所設計的雜交獲得的 而不是由外面亂飛的或非 處女雌蠅雜交得來的 經常你想要得到的果蠅只占子代總數的一小部分 并 且可能不是很健康 這就意味著 開始時要用足夠多的果蠅進行雜交 以便 你能有足夠的子代繼續(xù)后面的實驗 在室溫條件下飼養(yǎng)果蠅最容易 這還能防止培養(yǎng)箱出問題 這也是造成 果蠅絕種的主要原因 飼養(yǎng)果蠅最成熟的方法是在 25 C 和 60 相對濕度的 條件下 在這樣的溫度下果蠅傳代快 成活率高 發(fā)育時間最短 從卵到成 蟲約需要 9 10 天 如果在培養(yǎng)基中加入霉菌抑制劑傳代時間約增加兩 天 果蠅也可以在 18 C 和 29 C 下保存 相應傳代時間延長或縮短 并且 成活率低 對于純種果蠅的飼養(yǎng) 影響其壽命的唯一因素是其健康 老的培養(yǎng)基飼 養(yǎng)出健康的果蠅少 容易長霉菌和螨蟲 這些是果蠅的克星 好的經驗是每 兩周換一次培養(yǎng)基 25 C 條件下最多保存 18 天 雜交所產生的子代的培養(yǎng) 還有另一個限制 雜交 18 天后將產生第二代果蠅 由于你不知道它們的父 母是誰 它們的基因型誰也搞不清 純種果蠅可以不經麻醉換培養(yǎng)基 這只是一些手上的技巧 將果蠅磕到 老瓶的底部 輕點 以免果蠅被食物粘住 迅速拔掉瓶塞 將一個新瓶子 口對口倒置于老瓶上 瓶口對準 將瓶子翻過來 輕磕使老瓶子中的果蠅轉 到新瓶子中 輕輕地 不要將舊食物也轉到新瓶里 然后快速將新瓶子塞 好 最初幾周的操作中 可能會有許多果蠅跑掉 為了使跑掉的果蠅在實驗 室中最少 可以使用一些捕蠅的方法 簡單的可以用在一個干凈的培養(yǎng)瓶底 11 部放一些醋 少許去污粉和一個放在瓶子上的漏斗 以防止果蠅落水前跑 掉 復雜一點的是商品 bug lightes 象郊區(qū)后院用的那種 有時用紗網 門 但不利于防火 由于果蠅只能作為活體飼養(yǎng)保存 最好每一品種都有備份 并且能保證 隨時可以收集處女蠅 對于瓶養(yǎng)果蠅 可以養(yǎng)兩瓶 其傳代可以是同步的 也可以是相隔半代 給果蠅做標記也是同樣重要的 最簡單的方法是用一個 環(huán)行標簽將果蠅的全部基因型寫在上面 果蠅開始培養(yǎng)的日期也要寫在瓶子 上 以便你能確定果蠅的日齡 開始培養(yǎng)多少果蠅依賴于基因型的成活率 并且每種有一個最佳值 這 需要經驗 一般來說 突變越嚴重 特別是顯性的 成活率越低 染色體 重排 如 平衡子 復合染色體 降低果蠅的生育率 瓶中果蠅太少 培養(yǎng) 基將被霉和細菌吞噬 培養(yǎng)瓶中太多果蠅 培養(yǎng)基中由于積累過多 廢物 而變得很稀 以致從瓶中向外到果蠅時 培養(yǎng)基也跟著掉出來 搞得那都臟 兮兮的 過稀的食物還造成果蠅的翅膀粘到身體上 使分辨翅膀表型或其它 遺傳標記時產生困難 如發(fā)現(xiàn)食物變得越來越稀 你可以在食物中加入一小 片紙巾 為了防止紙生霉 事先應對其做防霉處理 野生型和那些單突變的 果蠅一小瓶需要 10 15 只雌蠅 大瓶要 25 35 只雌蠅 而小管只需 4 8 只 雄蠅的需要量比雌蠅少 因為它可以與多只雌蠅交配 有多重標記 顯性突 變和重排染色體的果蠅需要比上述多 1 到 2 倍的量 如果不知道需要多少果 蠅開始 最好的辦法就是在果蠅發(fā)育中經常觀察 當食物開始松動 特別是 靠近表面處 時 就表明有足夠多幼蟲 可以到掉親代的果蠅了 這大約需 要四天 依不同基因型而定 做雜交時 及時在子代羽化前將老蠅到掉是很 重要的 這樣就不會將子代和親代搞混了 這也是在瓶子上寫上開始日期的 另一個好處 1 7 精心于難養(yǎng)品系精心于難養(yǎng)品系 這個題目是指培養(yǎng)那些生存力弱的果蠅 挽救那些所剩數目極少的品 種 或者完成一對果蠅的交配 所采用的基本方針是 在新鮮的事物瓶中加 入新鮮的酵母 在理想條件下 25 C 60 相對濕度 飼養(yǎng) 并不時的祈 禱 如果你要在瓶中從雌雄果蠅開始飼養(yǎng) 當你發(fā)現(xiàn)有新的后代羽化出來 最好把它們轉入新瓶中 如果羽化的果蠅繼續(xù)留在原瓶中 將活不長久 這 樣你就開始了新的飼養(yǎng) 如果你有足夠的果蠅更快地傳下一代 你可以將親 代果蠅半途移到另一個新鮮的培養(yǎng)瓶中 這樣你最終得到的子代果蠅數會大 增 12 1 8 為雜交收集果蠅為雜交收集果蠅 為了能清楚的完成雜交 你必須從處女蠅開始 在 25 C 條件下 新羽 化 8 小時內雌性果蠅不會與雄蠅交配 這就意味著 通過在早晨和 7 8 小時 后分別收集兩次可以很容易獲得處女果蠅 早晨是大多數蛹羽化成成蟲的時 候 培養(yǎng)箱按晝夜規(guī)律照明 這是它們最為著名的晝夜規(guī)律 盡管你可能 不認為早晨的雌蠅都是處女蠅 但它們大多數是 這可以從它們蒼白的體 色 及透明腹部的黑點看出來 黑點為果蠅的標記 是腸道中的殘留物 如果你很精心地每個早晨都清光瓶中的成蟲 包括那些粘到瓶壁和食物上的 果蠅 則任何 7 8 小時內羽化的雌蠅都是處女 盡管它們看不出是新生的 樣子 在早晨能收集更多處女蠅的較有效的方法是在頭一天收集完后 將果蠅 在 18 C 過夜 在這樣溫度條件發(fā)育顯著減慢 新羽化的雌蠅 16小時內 98 不會交配 如果你上次瓶子的果蠅已經清理干凈 在早晨收集的果蠅可以看 作都是處女蠅 為此 你只需將飼養(yǎng)的溫度調為白天 25 C 夜晚 18 C 即 可 如果非處女蠅的后代容易分辨的話 2 的誤差不會有問題 否則還是 保守點好 對于很多雜交 為了控制非處女蠅的出現(xiàn) 可以使用 處女標記 雌 蠅帶有的純合隱性突變標記 在雜交后變?yōu)殡s合體 如果子代帶有這一標 記 它們就不是處女蠅的后代 可以扔掉 當你正處于雜交方案的半道上 你不是用純合品系果蠅進行交配 你仍能通過預期子代果蠅的基因型和由于 非處女蠅雜交產生的標記組合來加以區(qū)分 若你的雜交方案安排的很好 可 以做到上面這些 你就可以高枕無憂了 雜交所需的雄蠅可以隨時收集 值得考慮的是它們在 3 天或老一點時與 處女蠅交配最有效 太老 大于 10 到 15 天 的雄蠅沒有交配能力了 這是 由于雄蠅羽化后需要一個成熟過程才能與雌蠅交配 在這個意義上 雌蠅 在羽化后比雄蠅更成熟 盡管性別比例為 1 1 但每天收集的果蠅并不一定如此 雌蠅比雄蠅 發(fā)育快 故在最初出生的新蠅中雌蠅要比晚些時候的比例高 13 方便的方法是將你雜交前收集的果蠅在雜交時一起用上 因為可能要幾 天才能收集到足夠的果蠅 或因為食物未作好 或因為你愿意在周五開始你 的雜交工作 周五開始雜交有一個好處就是子代將在 10 天后也就是下周 一羽化 然后你又在隨后的五天收集子代 在周五繼續(xù)開始雜交 這樣你就 可以享受周末了 千萬別告訴你老板 新鮮的果蠅瓶是保存果蠅的好地 方 每瓶 20 30 只 如果果蠅在瓶中呆了好幾天了 就應該轉到新瓶中以保 持果蠅健康 在不擁擠的新鮮瓶中果蠅可以活 40 60 天 可是它們的生育率 將逐漸降為零 在保存期 若沒有幼蟲在食物中蠕動 就可以保證你的果蠅是處女蠅 在保存期末了 你還可以將雌雄果蠅混在一起飼養(yǎng)一天 這時你在用新瓶進 行正式雜交時 雌蠅此時已經交配過了 象許多次級反應一樣 在瓶中擁擠 的情況下 雌雄果蠅相遇的幾率高 雜交速度快 現(xiàn)在 大部分人用CO2來麻醉果蠅以便收集處女蠅和進行標記檢查 各 種器械被設計用來釋放CO2于一個平坦平臺 在操作時使CO2 保持在低水 平 通常先用軟管插入培養(yǎng)瓶中麻醉果蠅 或是直接到在麻醉器上 一個使 果蠅接觸的可滲透容器 傳統(tǒng)麻醉果蠅的方法是用乙醚 乙醚麻醉儀是一個封閉的容器 一塊棉 花放其底部澆上乙醚并用一個透氣的管子裝果蠅 注意不要過度麻醉果蠅 用CO2 就不會有這種事 一旦果蠅麻醉了 就必須在它們蘇醒過來之前 完成分類工作 夏天熱時醒的快 這種麻醉方法對行為有不利的影響 CO2 和乙醚都在一定時間內損害神 經活動 所以在做行為檢驗前 應讓麻醉的果蠅至少恢復 24小時 1 第二章第二章 分離新的變種分離新的變種 我們利用果蠅作為研究對象并不是因為它們格外聰明 而是因為突變 我們 可以獲得突變并研究分析這些突變 我們今天的果蠅的分子生物學大廈正是以此為 基礎的 大多數的遺傳學方法是不適合于定點突變的 突變某一預定好的基因 就如 小鼠中的敲除技術一樣 實際上它們大多是隨機的 然后采用遺傳檢測的手段來來 確定特定的突變 而在微生物遺傳學中的篩選方法基本上都不適用于果蠅 許多的單個 F1 果蠅在其全部的性細胞中有一套突變的染色體 由于化學突變 劑常作用于 DNA 雙螺旋的某一鏈上 F1 代果蠅將會是嵌和體 因為染色體是采用 半保留復制的 也就是說 DNA 的單股序列的改變只會傳到下一代果蠅的一半的 細胞中 在首次有絲分裂之后 故新的突變會在下一代果蠅的某些細胞出現(xiàn) 而 在另一些細胞中卻沒有 若這個突變只在組織細胞中表達而不在生殖細胞中表達 這可能會產生一個不可遺傳的突變的表型 但 F1 代的性細胞卻很少是嵌和的 因 此尚需做進一步的雜交實驗來揭示某些子代果蠅的突變 當然在另一些果蠅中突變 性狀會被恢復 突變體突變體 突變劑的選擇取決于你所需要的突變類型和你計劃在此花費的時間的長短 化 學突變劑最適合于獲得單點突變 或者小的基因內缺失 因此它們比較適合獲得 等位突變序列或者是條件突變 如溫度敏感型 以及事先確定表型的突變 如學 習突變體 放射法最適合制造重排 比如易位 重復 缺失和倒置 而插入突變 則最適合于突變基因的快速分子克隆 其衍生出的一種技術增強子陷阱則可基于增 強表達的模式來鑒定基因 誘變劑的介紹誘變劑的介紹 EMS EMS 是最為常用化學的誘變劑 它是一種烷化試劑能導致大量的點突變 盡 管也能造成小的缺失和其它重排 其使用劑量取決于所采用的遺傳分析方法 比如 在尋找新突變時需要采用低劑量 而在已有突變的基礎上尋找新的突變則需要較高 的劑量 這是因為在前一種情形中染色體必須弄成純和的 而后者中突變將用另一 種染色體來檢驗 這其中的道理便在于當你弄出純和的突變染色體以尋找特定表型 2 時 你不希望其它的純和突變 尤其是隱性致死突變也同時存在 從而使原定的方 案復雜化 在低劑量條件下雄蠅進食 2 5MM 的 EMS1 蔗糖溶液過夜 結果平均每一條 染色體都會發(fā)生一個致死突變 或者說突變比率為每個基因位點平均每千條染色體 會發(fā)生一次突變 也就是說你在檢驗某一果蠅的后代時 你就會發(fā)現(xiàn)每六個果蠅 的染色體上有一個新的致死突變 如果你分析某一位點新突變 那么你將從大約一 千條染色體中分離出一條在此位點突變的染色體 這和每條主要染色體臂上約有 1000 個致死基因是一致的 而當突變染色體必須在雜和條件下分析時 則劑量應 該加倍 比如通過缺失分析新的突變時 假設每條臂有 1000 個致死基因 而且 只有一個發(fā)生致死突變 突變處理后的果蠅與雌蠅交配 4 5 天 然后雄蠅移走 這么做是為了增加特定 突變染色體的比例 因為誘變劑也能影響干細胞 當此細胞受影響時 會產生同樣 突變的多個精子 由于干細胞的敏感性較差 其染色體的突變率較低 因此突變處 理后的雄蠅必須在這些干細胞轉化為成熟精子細胞前拋棄 由此保證各突變是獨立 被誘導的 獨立誘導突變的好處在于你不必浪費時間把同一突變分析多次 而且在 試圖達到突變飽和時 唯一的檢驗飽和與否的方法是獨立突變的重復頻率 一個 生殖干細胞分解成四個精子 如在干細胞水平發(fā)生突變則四個精子都帶有突變 會 大大增加篩選的難度 因此我們要保證各個突變是獨立被誘導的 EMA 作用于 DNA 雙螺旋的一股 這意味著 F1 后代將是嵌和型的 至少在某 種程度上是 但這只是在檢查 F1 代表型時起作用 因為新的突變在生殖細胞和體 細胞都必定存在 體細胞的突變表型是必定可以檢測到的 即使不是所有的細胞都 發(fā)生突變 待處理的雄蠅最好是 3 5 天的 最容易交配 但是必須注意的是許多果蠅會在 處理中死亡 存活也并非全都可育 許多的 F1 后代也是不育的 故而完全有必要 預處理大量的雄蠅 大約是你需要的 F1 后代數的一半 同理通過預實驗來估計 果蠅的突變劑敏感性也是個明智的辦法 預實驗的一個好處是估計你的雜交方案能 否獲得你想要的后代果蠅 當然 很多主意有時看起來很不錯 但在實際操作中卻 常歸于失敗 ENU 我們假設象 EMS 這樣的試劑在染色體上的作用位點是完全隨機的 但事實并 非如此 這在另一種誘變劑所誘導的突變中尤其如此 在使用 ENU 時 盡管總的 突變率與 EMS 相當 但是在基因的突變率和所獲得的突變方面卻不太一樣 F1 子 代中重排的頻率和出現(xiàn)嵌和體的幾率都有所下降 在其它方面 ENU 和 EMS 的突 3 變原理和操作方法都差不多 7 5MM 的 ENU 可在 40 的染色體上造成致死突變 ENU 比 EMS 對哺乳生物的毒性更大 可高頻的誘發(fā)小鼠的腦腫瘤 許多的果 蠅工作者出于安全考慮都不用 ENU 放射法放射法 X 射線是最早的誘變方法 至今仍是許多科學家的重要手段 獲得放射源的最 簡單途徑是 X 光機和鈷或銫源 它們都能導致染色體斷裂 有時又隨即修復 可 以獲得易位 缺失 轉座和倒置等各種重排染色體 若是染色體斷點正好落在某基 因的區(qū)域內或是將特空的區(qū)間合在一處 就有可能導致突變型的出現(xiàn) 此即所謂的 倒置現(xiàn)象 有時放射性也可導致點突變 成熟的精子細胞對放射誘變最合適 但由于其中只有一套染色體 故其重排范 圍有限 比如同源染色體之間的重排事件就不會發(fā)生 放射性處理的誘變頻率比化 學誘變劑低的多 4000r 的放射量在每條染色體臂只能造成 5 的致死突變 而標 準計量 EMS 則為 60 而這已經是造成過度不育前提下的最高劑量 由于斷裂是 DNA 兩股同時進行 后代果蠅中不會有嵌和體現(xiàn)象 否則 可依照化學誘變的方 法進行處理 插入突變法插入突變法 通過轉座子的插入來打斷基因的方法并不是最容易的方法 但是其標記基因或 者是 增強子陷阱 的優(yōu)點足以抵銷其不便之處 其基本原理是將可移動基因片 段轉移并插入染色體的新位點中 又稱為雜交不育 P 因子是最常用的轉座子 最 近又發(fā)現(xiàn)了 Hobo 因子 P 因子突變可利用完整的轉座子進行 如含有許多 P 因子 的果蠅品系 也可以利用缺陷轉座子 它可以被轉座但自己不能單獨完成 這些缺 陷轉座子必須在引入別的轉座酶來源 通常是整合有轉座酶的基因后 才能發(fā)生轉 座 缺陷轉座子的好處是轉座事件可以只通過引入或移走轉座酶來控制 實際操作 中則是通過引入或移走含轉座酶的染色體 當把轉座子和轉座酶置入同一只果蠅的 細胞時 其發(fā)生轉座插入的果蠅就可能產生突變后代 打個比方 雜交中帶有轉座 子的果蠅經轉座酶的處理 發(fā)生突變 就象是染色體受到化學誘變劑的處理一樣 在這種方式中 分離突變體過程同樣沒有嵌和體出現(xiàn) 只須將轉座酶移走即可 轉座發(fā)生的頻率是切割頻率和插入頻率的組合 前者和轉座子的大小和堿基序 列有關 后者則完全取決于插入位點的序列 某些位點如 Sn 的插入頻率高達 1 另一些如 Adh 則基本上沒有插入 平均起來位點插入幾率為 1 2000 改變這種插 4 入不平衡現(xiàn)象的一個好辦法就是尋找更多的類型的轉座子 常染色體上新的等位基因的檢出常染色體上新的等位基因的檢出 通常深入研究某一基因的行為可以用分析等位基因序列來進行 基因所參與的過程 越是復雜 這中分析方法就顯得越重要 其基本方略就是經典 互補檢驗 新突 變的染色體與該位點的已知等位基因進行雜合 這種方法的關鍵在于發(fā)生新突變時 能和原來的等位基因型的表型區(qū)分開來 下面是一個簡單的例子 是關于分離第三 染色體上的新的隱性突變 突變野生型雄蠅 與帶有雜合顯性標記 Sb 和 Ubx 標記的 TM6 平衡染色體的 處女蠅雜交 但事實上 人們很少用野生型的雄蠅 而實際采用某些有純和標志基 因的雄蠅 如 e e F1 后代中一個是Ubx而無Sb 即Sb 另一種為Sb而無Ubx 即ubx 挑出Sb ubx 的雄蠅 它們單只與有nkd 和TM3 ser雜合的處女蠅雜交 在F1 后代的基因 型為 5 在此草圖中 各同源染色體均已列出 他基本上反映突變染色體的擴增過程 第一次雜交是群體進行的 因為在一個突變雄蠅中 其精子的基因型是特異的 其 F1 代現(xiàn)在各有一單套突變染色體 故通過與處女蠅一對多式的交配可以檢出所想 要的突變 開始時雄蠅的數量取決于你想在 F1 代中挑出的用于雜交的雄蠅數量 大體上首次處理的雄蠅數目應是想在 F1 代獲得雄蠅的兩倍 而在 F1 代所要的雄 蠅數目則取決于你愿意投入的時間和精力 野生 雄蠅一般帶有些標記基因 如 e 這有助于在后面純和存活的檢驗雜交中認出突變染色體 這一方案也顯示了明確判定基因型的基本原理 每一種后代可以通過顯性標記 的有無很容易判斷出來 class1 中沒有任何顯性標記 如果沒有 class1 型子代出現(xiàn) 那么你可能誘導了一個新的突變 它不能彌補 nkd 的致死性 但這種情況很少見 故一般情況下 25 的此代果蠅是沒有顯性突變的 這類果蠅中也可以分現(xiàn) nkd 新 的等位突變 如果能設法辨別出來的話 它們跟原來的 nkd 等位基因在表型上可以 相同也可不同 如果在此過程中有那么一兩瓶果蠅有新突變 這個方法可以說是鑒別突變染色 體的好方法 而且最初的那只雄蠅不必存活 新的突變也可以在 class2 中檢出 它 們有從基因親處繼承而來的 TM3 ser 此方案中很重要的一點是在第二次雜交中 用了兩個不同的顯性突變 它們基本上是染色體的商標 也就是說 在 F1 代有 sb 的果蠅就攜帶突變染色體 e 類似的是第二次雜交時的雄蠅 有 ser 就表示帶有 nkd 由于這些顯性標記在下一代與其同源染色體分離 故 F2 后代中有 ser 的必有 e 無 sb 有 sb 的必有 nkd 這是鑒定基因型最有用的方法之一 特別是你所要研 究的突變是隱性時 但如前所說這種方法的成功有賴于雄蠅中重組現(xiàn)象的絕跡和雌 蠅中重組為平衡染色體所抑制 關于這個方案要說的最后一點是你可以為新的致死突變建立平衡體系 收集 class2 中的處女蠅和雄蠅 你可以得到一個品系 其存活后代的基因型與親代一樣 任何純和體都不能存活 2 3 2 X 染色體上新的等位基因的檢出染色體上新的等位基因的檢出 在常染色體上獲取定點突變是很直接的 但若是雄蠅在 X 染色體發(fā)生致死突 變則會麻煩的多 這是因為雄蠅只有一條 X 染色體 隱性突變基因可以充分表達 X 染色體上若有致死突變 將在傳代過程中會遇到很多麻煩 檢驗新的突變一定要有 互補 必須使繼承此突變的雄蠅能存活 最簡單的 解決辦法莫過于采用正常區(qū)段的重復以實現(xiàn)變相雜合 這可以是在 Y 染色體上重 復 X 染色體上的某一正常區(qū)間 也可以在常染色體上進行重復 下面便是有代表 性的一例 要分離的是 armadillo 其初始野生型有 y 突變 6 這一方案顯示了一些X染色體所特有的特征 我們注意看親代的雜交 X X arm Y 有y標記的連體X和Y染色體 后者有正常armadillo基因 記住這條Y即不能該改變 性別也不能改變生育能力 這種情況下 Y將與X X在減數分裂時分離 故其后 代要么有X X 要么有arm Y 當經過攜父親性染色體的精子受精后 產生的后代 就是 但只有b和c種是可存活的 a有三條X而d有兩條Y不可活 b繼承母親的X X和 父親的Y 而c有正常的染色體組成 如果突變成功 則c果蠅有突變x染色體及一 個Y重復 它覆蓋了armadillo 突變 也就是說若X有新的arm突變 雄蠅中它將為 arm Y所挽回 若是在此區(qū)域以外有突變 則不可挽回而不能存活 當然這也不 是你想要的 在F2 代 class1 可以用于檢驗是否是armadillo的新等位突變 y arm 這可以 育用來判斷class2 是否有這種新染色體 它已為FM7b所平衡 如果是 則class2 處 女蠅跟FM7b y雜交 即可建立所要之品系 由于FM7b有l(wèi)2sp 是雌性純和不育的 故其后代中只有一種交配類型 即y FM7b和y FM7b 7 2 3 3 通過突變鑒定新基因通過突變鑒定新基因 我們現(xiàn)今關于果蠅受精卵發(fā)育過程模式的遺傳控制圖譜的知識 絕大多數來自 Wieschaus 和 Nusslein Volhard 在 70 年代所分離出來的一系列突變體 他們所采用 的是經典的利用突變分析來發(fā)現(xiàn)影響表型的新基因的方法 他們只采用了一個假 設 即影響成熟受精卵殼甲發(fā)育模式的基因在果蠅中是存在的 這個方法還有個好 處是它沒有什么偏好 任何參與此過程的分子都有機會被發(fā)現(xiàn) 而事實上這 一點已經被轉錄因子 受體酪氨酸激酶和緊密連接分子的發(fā)現(xiàn)而被證實 這種方法 是為了發(fā)現(xiàn)任何影響殼甲表型的位點而設計的 要達到這一點他們要獲得許多突變 染色體純和的品系 而且要有簡捷的方法將模式的改變辨認出來 而下面則是更為 基本且適用的一種方法 2 3 3 1 單一化初始品系單一化初始品系 這里我們以要得到的純和致死突變?yōu)槔?這首先就需要保證這起始品系本身沒 有攜帶致死突變 乍看起來 這一步顯得多余 因為果蠅既然是活的 似乎就不該 有致死突變 可是事實是殘酷的 盡管隨機突變率通常低得可以忽略不計 但并不 等于零 它們隨時可以發(fā)生 在小的群體中 如一個培養(yǎng)瓶中 這些突變甚至可以 在群落中起主導地位 有些是隱性致死的 一些活的果蠅也可以在雜合狀態(tài)下攜帶 此突變 只要有 1 那么一丁點的果蠅是攜帶者 而此果蠅又是作為初始品系的化 則你要分離得到的突變極有可能是已經存在了 當然 對于調皮的本科生或是某些 以實驗來消遣假期的人來講這個方法還不賴 對于你真正的研究者 這可不是一個 好主意 怎么辦呢 可以單一化初始品系 也就是說 從單一一條染色體獲得一個新品 系 然后在發(fā)生隨機突變之前馬上用于突變實驗 下面是個單一化第二染色體的草 圖 此染色體攜有眼色標記 cinnabar 和 brown 共存時形成白眼 這有利于鑒定 致死突變 8 在 F1 這一步 單條的 cnbw 染色體被擴增 在 F2 代中都有了同一條 cnbw 它 是不能和其同源的 In 2LR O Cy 染色體重組的 到了 F3 代 就得到單一第二染色 體的品系 在 F1 階段準備多分是個好方法 因為若你只做了一個雜交而恰好 cnbw 染色體有個致死突變 那你就一無所獲 事實上因為是單只雄蠅雜交 你完全可以 根據最后的結果判斷出有一個致死突變存在 在保證 cnbw 染色體能最終存活的 同時 你還應該注意觀察它們是否足夠 健康 正常情況下 cnbw In 2LR O Cy 的比例是 1 2 2 3 3 2 突變篩選突變篩選 現(xiàn)在我們還回到突變上來 上述的這點麻煩事僅會用去 8 周時間 而在此時間 內 你完全可以將實驗中要用到的果蠅偶像擴增到足夠的數目以用于大規(guī)模的實驗 分析 而且 你還可以在這段時間內看你要用的品系是否出了問題 大體分析方法 如下 9 從原理上講 這個方案跟單一化 cnbw 染色體的方法很類似 誘變 cnbw 需要 使之與帶平衡染色體的雌蠅雜交 得到單獨的與顯性標記染色體配對的突變染色 體 再將這種雄蠅與有帶同樣的平衡子和顯性標記染色他雌蠅雜交 于是這個突變 染色體就可以變成純和態(tài)的了 這個方案較有特點的是使用了 DTS 此突變攜帶者在 29 度以上培養(yǎng)時會死亡 它在發(fā)育時起作用 一般是在產卵后將培養(yǎng)瓶移至高溫處 使用 DTS 的好處是 F2 代不必費力的去挑選處女蠅了 想想吧 通常得挑上一萬瓶 DTS 的殺傷作用只 有 cnbw In 2LR O Cy 可以幸免 只須傾掉親代果蠅 讓子代果蠅自行交配即可使 cnbw 純和 唯一的要求是 F1 代需要挑出大量的處女蠅 但這里也必須注意 如 要尋找的突變是溫度敏感的就不能使用 DTS 了 當 F3 代出世時 你只須看看瓶子里有無白眼就可以了 有則無致死突變即可 以扔 如果沒有 則你已經得到了新的已平衡好的致死突變了 從另一方面看 如 果你要找可活的突變那你就該保留此瓶 這個方案還有些可能發(fā)生問題的地方 但只須稍加注意即可 首先 說 沒有 白眼即有突變 是基于果蠅的數量很大的條件的 若果蠅不多 則可在下一代進行 擴增來進行驗證 其次 在子代果蠅出生之前一定要將親代果蠅除去 才能保證操 作與方案一致 最后 DTS 在實驗前必須檢驗 看是否能正常其作用 以免遺漏 10 從帶標記的染色體開始突變有很多優(yōu)點 檢驗出致死突變的方便之處自不待 言 這兩個標記也有助于日后對突變進行定位作圖 而且它們有助于你不重復分 離 你的同事已分離出的突變 因為果蠅間的污染時有發(fā)生 有了標記你就不會 誤拿同事的果蠅而交叉污染了 這些事看來不太可能 但卻必須嚴肅對待 有時直 到最后發(fā)現(xiàn)兩個突變一樣時才發(fā)現(xiàn)犯了錯誤 當然 除了致死突變 別的可存活但也很有趣的突變也會同時發(fā)生 各種新突 變都有可能 2 3 3 3 篩選篩選 X 染色體上的新基因染色體上的新基因 在具體到 X 染色體這一特殊情況時 無疑 Wieschaus 和 Nusslein volhard 設 計了一個有效的方案 這個例子很簡單 也很有說服力 首次雜交中處女蠅的基因型為 FM7 TW9 any lethal 是關鍵 FM7 TW9 是 FM7 的變種 有隱性致死突變 另一條染色體可以帶 任何致死突變 以保證此雌蠅可活 而后代中雄蠅不能存活 故其后代就都是處女 蠅而不必挑選 將這只雌蠅與 FM7 雄蠅交配 若后代有 Y 型雄蠅則無新的致死突 變 反之則有 這一方案同樣要求用大量的果蠅以獲得足夠多的子代來保證確定沒有 Y 型雄蠅 產生 由于這之中有一步是單只雌蠅雜交 這一要求顯得尤為重要 由于單只雌蠅 交配可能不能在一個瓶中形成群落 所以應該多準備幾份以備不測 提高成功率 2 3 4 插入突變和增強子陷阱插入突變和增強子陷阱 果蠅中P因子轉化作用發(fā)現(xiàn)不久 可以插入產生突變并對之進行標記的轉座子 便迅速擴展到果蠅研究的各個領域 它幾乎達到小型的產業(yè)化 使用簡單的攜帶有 ry 或neo 轉化載體即可 一種改進的方法 增強子陷阱P因子在插入基因特異表達 11 的組織部位表達 半乳糖苷酶的方法 P因子插入的應用更廣泛 現(xiàn)在全世界幾乎 沒有一家果蠅實驗室沒有自己的增強子陷阱品系 插入突變最早是由于它利于克隆被打斷的基因而頗受青睞的 而質粒挽回序列 的引入則使它變得更容易了 這足夠彌補它在突變率低上的不足 換句話說 這種 技術就是一種誘變手段 而借助基因表達模式分析突變的增強子陷阱技術則是鑒 定基因的一種全新的方法 新的