minRNA檢測方法.doc

microRNA（miRNA）是一種機(jī)體內(nèi)源性表達(dá)的單鏈小分子RNA，位于基因組非編碼區(qū)，本身不具有開放閱讀框（open reading frame，ORF），具有高度保守性，時序性和組織特異性。miRNA廣泛存在于各種真核細(xì)胞中，不編碼任何蛋白質(zhì)，長度僅為2024nt。成熟的miRNA 5端有一個磷酸基團(tuán)，3端為羥基，由具有發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)的約7090nt的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer酶加工后形成。成熟的miRNA形成RNA誘導(dǎo)的基因沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC）作用于靶點mRNA，通過對mRNA剪切或抑制其翻譯過程而調(diào)控基因的表達(dá)。目前人們還不明確miRNA及其靶mRNA之間的作用機(jī)制。 最近有研究指出，miRNA在細(xì)胞生長、發(fā)育、分化、死亡等生物過程中起著重要的作用，同時，miRNA參與了血細(xì)胞生成、胰島素分泌、神經(jīng)系統(tǒng)構(gòu)成和人類癌細(xì)胞生長等不同的過程，因此，非常有必要開發(fā)有效的實驗工具來測定miRNA。 目前檢測miRNA的方法主要有Northern印跡分析，微點陣（microarray）分析和實時定量PCR（quantitative Real-Time PCR）。下面將對這三種方法做簡單的介紹及比較。1、Northern印跡分析（Northern Analysis） Northern印跡是基于雜交檢測RNA的常用方法，它是最早用于miRNA分析的幾種方法之一。這種方法簡單易行，大部分實驗室都可以進(jìn)行操作，不需要額外的資金投入與設(shè)備更新。不足之處：1）Northern分析的過程涉及大量人工操作，并且每次僅有一條miRNA探針與一個RNA印跡雜交，因此，它適用于不適用于大規(guī)模的篩選實驗。盡管如此，在簡單探究miRNA功能機(jī)理的實驗中，Northern印跡分析還是能夠滿足研究需要的。2）Northern印跡分析的動態(tài)范圍只能達(dá)到兩個數(shù)量級，這就引發(fā)了一個嚴(yán)重的問題，進(jìn)行實驗的細(xì)胞內(nèi)的miRNA分子的數(shù)量要達(dá)到比較大的范圍，例如，能夠檢測40,000個miRNA分子每細(xì)胞的印跡條件實際上卻不能準(zhǔn)確檢測10個miRNA分子每細(xì)胞。另外，由于Northern印跡以雜交為原理，它通常不能有效區(qū)分具有細(xì)微序列差異的miRNA。例如，同一個家族中的miRNA let-7c與let-7a和let-7b之間僅有一個堿基的差異，導(dǎo)致Northern印跡分析無法清晰區(qū)分它們。此外，Northern印跡實驗的重復(fù)性較弱。3）Northern印跡耗時，耗量。進(jìn)行一次miRNA檢測需要3個工作日，不僅減慢了實驗進(jìn)程，也增加了雜交膜上信號擴(kuò)散的風(fēng)險。此外，Northern印跡大概需要5到10微克的總RNA量上樣量才能成功檢測出miRNA，增加了檢測干細(xì)胞或人類初期腫瘤細(xì)胞這些稀少的樣品的難度，甚至無法順利開展實驗。2、微點陣（Microarray）分析 微點陣分析也是基于雜交的原理來檢測miRNA，它通過測定特定過程中miRNA的表達(dá)水平，來分析了解miRNA的表達(dá)調(diào)控機(jī)制以及由miRNA調(diào)控的基因的表達(dá)。微點陣采用高密度的熒光標(biāo)記探針與RNA樣本雜交，通過熒光掃描獲得表達(dá)圖譜，借助相應(yīng)軟件進(jìn)行miRNA的表達(dá)分析。由于在設(shè)計探針時可以包含所有可用miRNA序列，因此微點陣可以作到高通量的miRNA分析。不足之處：1）微點陣仍然需要足夠的RNA初始樣本，大約為每個微點陣5微克。2）由于微點陣以雜交為基礎(chǔ)，因此同Northern印跡一樣無法清楚的區(qū)分序列差異很小的miRNA。另外，微點陣也很難區(qū)分具有相同序列的前體miRNA和成熟的活性miRNA。3、定量實時PCR（Quantitative Real-time PCR） 定量實時PCR技術(shù)通過擴(kuò)增技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。起始目標(biāo)核酸的拷貝數(shù)越高，就越快觀察到熒光強(qiáng)度的顯著增加。定量實時PCR中TaqMan (Roche Molecular Systems Inc., Basel, Switzerland)特異性分析依賴于兩個PCR引物和一個序列特異的TaqMan探針的聯(lián)合作用。這些熒光標(biāo)記的探針利用Taq DNA聚合酶的5核酸酶的活性，極大的提高了實時PCR的檢測，從而使得對PCR后期加工中探針的降解分析的評估成為可能。 盡管定量實時PCR相比Northern分析和微點陣需要較少的樣本，并且顯著的提高了動態(tài)范圍和敏感度，但是這種技術(shù)在檢測miRNA時還是遇到了挑戰(zhàn)。由于成熟miRNA長度較短，難以設(shè)計成熟miRNA的有效的特異引物和探針，于是很多研究者對較長的前體miRNA分子進(jìn)行定量實時PCR檢測，利用前體miRNA的水平作為成熟的活性miRNA的替代標(biāo)記。然而細(xì)胞內(nèi)存在的前體miRNA的水平不能有效的指示相應(yīng)的成熟miRNA水平，因此這種方法無法達(dá)到預(yù)想中的效果。 目前已有新的定量實時PCR的方法被用來解決檢測miRNA中遇到的這些問題。這種新方法利用一種莖環(huán)（stem-loop）狀引物進(jìn)行miRNA的反轉(zhuǎn)錄，然后再進(jìn)行定量實時PCR。這個莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)對成熟的miRNA 3 端具有特異性，能夠?qū)⒎浅６痰某墒靘iRNA分子擴(kuò)展并且增加一個通用的3 引物位點進(jìn)行實時PCR。這種莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)也被認(rèn)為可以形成一種空間的阻礙以防止對前體miRNA進(jìn)行PCR引導(dǎo)。然后就可以利用實時PCR進(jìn)行高特異性的定量檢測miRNA的表達(dá)水平。這種實時PCR的優(yōu)點是：1）可以在起始樣本量很小的情況下進(jìn)行（RNA總量在1到10ng之間）。2）動態(tài)范圍達(dá)到了7個數(shù)量級，因此可以檢測大量或者少量的miRNA。3）這種方法可以區(qū)分只有一個堿基差別的miRNA。4）和傳統(tǒng)的定量實時PCR檢測相比，在實驗室中生產(chǎn)這些新的莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)是很快并且很簡單的。三種檢測方法的比較Northern印跡微點陣定量實時PCR初始樣本量510微克大約5微克110納克敏感度低中等高特異性低中等高動態(tài)范圍2 logs4 logs7 logs通量低高中等、高實驗時間幾天幾天幾小時區(qū)分前體與成熟miRNA的可靠性是（miRNA數(shù)目少時無法區(qū)分）否（需要額外的區(qū)分大小的步驟）是能否區(qū)分序列差別少的miRNA不能不能能參考文獻(xiàn)：1Yingqing S, Seongjoon K, Neill W, et al.Development of a micro-array to detect human and mouse microRNAs and characterization of expression in human organs. Nucleic Acids Res,2004,32 (22): 248624942Caifu C, Kelly M, Ada H.W, et al. Real-time PCR:Advancing RNA Interference and MicroRNA Studies. Nucleic Acids Research, 2004,32,(22): e188盡管早在1993年，科學(xué)家就發(fā)現(xiàn)了第一個microRNA，但直到2003年以后，這種小RNA分子的大作用才不斷被發(fā)現(xiàn)。研究顯示：miRNA通過與轉(zhuǎn)錄本的相互作用，關(guān)閉或抑制基因的表達(dá)，影響了30%的基因。miRNA在多個組織中，例如正常和腫瘤組織中差異表達(dá)。因此，通過表達(dá)譜分析尋找疾病相關(guān)miRNA并進(jìn)行發(fā)病機(jī)理研究，最終應(yīng)用于腫瘤診斷和治療，已經(jīng)成為目前miRNA研究的重要方向。在研究中，從深度測序、miRNA芯片到通過導(dǎo)入化學(xué)合成的mimics/antagomirs等實現(xiàn)miRNA過表達(dá)和抑制，都是研究中常用的方法。同時，在miRNA研究中，生物信息學(xué)分析扮演著越來越重要的角色。下表介紹了miRNA研究和應(yīng)用中科學(xué)家關(guān)注的主要科學(xué)問題以及目前常用的研究方法。問題目的研究方法應(yīng)用有哪些miRNA表達(dá)？miRNA表達(dá)情況深度測序&生物信息學(xué)分析生物信息學(xué)分析預(yù)測可能的miRNA，進(jìn)一步驗證發(fā)現(xiàn)新的候選miRNAmiRNA何時表達(dá)？在哪里表達(dá)？表達(dá)差異？miRNA表達(dá)特征miRNA芯片，磁珠流式細(xì)胞miRNA表達(dá)譜qPCR對hit miRNA進(jìn)行驗證，Northern Blot，原位雜交等發(fā)現(xiàn)差異miRNA，為進(jìn)一步功能研究、診斷，預(yù)后判斷，療效檢測等奠定基礎(chǔ)miRNA控制哪些基因？這些基因功能？所在信號通路？miRNA功能分析生物信息學(xué)分析qPCR對hit mRNA進(jìn)行驗證，Western Blot等方法檢測蛋白表達(dá)水平轉(zhuǎn)入miRNA mimics觀察相應(yīng)mRNA&蛋白水平變化以及相關(guān)現(xiàn)象（miRNA低表達(dá)情況）轉(zhuǎn)入miRNA antagomirs觀察相應(yīng)mRNA&蛋白水平變化以及相關(guān)現(xiàn)象（miRNA低表達(dá)情況）機(jī)理研究，功能研究miRNA如何控制靶miRNA確定結(jié)合位點生物信息學(xué)分析miRNA結(jié)合靶mRNA 3UTR的可能序列構(gòu)建包含miRNA結(jié)合位點（3UTR）以及位點突變的螢光素酶報告載體進(jìn)行驗證機(jī)理研究miRNA功能（與特定疾病、表型的關(guān)系）miRNA功能分析細(xì)胞水平：過表達(dá)及抑制實驗（見前），觀察表型及現(xiàn)象變化以及上下游通路變化動物模型：過表達(dá)及抑制實驗（見前），觀察表型及現(xiàn)象變化以及上下游通路變化臨床組織樣本，檢測miRNA表達(dá)情況與疾病相關(guān)性功能研究miRNA應(yīng)用于診斷診斷選擇疾病相關(guān)的一個或一組miRNA，或結(jié)合其它基因水平變化，進(jìn)行q-RCR等檢測診斷，預(yù)后判斷，療效檢測miRNA應(yīng)用于治療治療轉(zhuǎn)入合成的小分子miRNA模擬物（miRNA低表達(dá)情況）或拮抗劑（miRNAG高表達(dá)情況）治療miRNA主要研究技術(shù)深度測序 抽提分離小分子（例如18-30nt）RNA，通過RT-PCR擴(kuò)增之后，利用solexa深度測序，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲得miRNA表達(dá)譜。深度測序結(jié)合生物信息學(xué)分析手段，可以對海量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，分別統(tǒng)計出已知的miRNA（miRNA-known）、新的miRNA（miRNA-new）以及可能的新miRNA（miRNA-cadidate new），并對新發(fā)現(xiàn)的miRNA進(jìn)行靶基因分析，功能預(yù)測等。通過深度測序的方法，可以發(fā)現(xiàn)新的miRNA，為進(jìn)一步的深入研究奠定基礎(chǔ)。miRNA芯片 利用miRNA芯片（例如Agilent miRNA芯片），可以高通量分析miRNA表達(dá)的時空特異性、不同樣本（例如癌組織和癌旁組織）中miRNA的差異表達(dá)，進(jìn)而進(jìn)行把基因分析，功能注釋、通路分析，網(wǎng)絡(luò)分析等，以了解miRNA在疾病發(fā)生中的作用。與深度測序不同，miRNA芯片針對已知miRNA進(jìn)行研究。篩選到的差異miRNA可以利用q-pCR進(jìn)行驗證。q-PCR q-PCR技術(shù)可以用來檢測miRNA以及其靶mRNA和相關(guān)mRNA等的檢測，主要方法有莖環(huán)法和加尾法等。前者針對特定miRNA設(shè)計引物，特異性好，然而成本較高，周期長；后者采用通用引物，時間短，通量較大。(歐易生物為您提供以上項目的優(yōu)質(zhì)服務(wù)，詳情請關(guān)注：)Mimics以及Antogomirs 通常基因功能研究常常采用過表達(dá)或干涉（抑制、敲除）等方法，miRNA研究也不例外。通過導(dǎo)入化學(xué)合成的小分子miRNA mimics或拮抗miRNA 的antagomir，觀察靶mRNA及編碼蛋白表達(dá)以及細(xì)胞、動物水平的表型變化，進(jìn)行信號通路研究，是目前miRNA功能研究的常用方法。螢光素酶報告系統(tǒng) 在確定了靶mRNA之后，找到位于3-UTR區(qū)的miRNA結(jié)合位點是研究者下一步關(guān)心的內(nèi)容。通過生物信息學(xué)分析獲得候選的miRNA結(jié)合區(qū)域，將野生型和結(jié)合位點突變的3-UTR序列克隆入商品化的螢光素酶報告載體（例如pMIR-REPORT? miRNA Expression Reporter Vector系統(tǒng)），通過觀察miRNA對發(fā)光強(qiáng)度的影響對結(jié)合位點加以驗證。miRNA的研究方法還有很多，例如磁珠流式細(xì)胞儀分析miRNA表達(dá)譜，Northern Blot或核酸原位雜交檢測miRNA的表達(dá)，miRNA克隆、測序等等。另外，在miRNA研究中，隨著高通量測序、芯片的技術(shù)不斷發(fā)展，另一個重要的工具-生物信息學(xué)分析發(fā)揮著越來越重要的作用。miRNA研究中常用的軟件和數(shù)據(jù)庫資源以下是常用的microRNA靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫和軟件資源列表，希望對microRNA的研究者有所幫助。（1）miRbase：眾所周知的microRNA基因注釋數(shù)據(jù)庫。目前miRBase只提供了microRNA的靶標(biāo)的預(yù)測軟件的鏈接（如：PicTar）。 網(wǎng)址：/index.shtml（2）starBase：一個高通量實驗數(shù)據(jù)CLIP-Seq（或稱為HITS-CLIP）和mRNA降解組測序數(shù)據(jù)支持的microRNA靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫，整合和構(gòu)建多個流行的靶標(biāo)預(yù)測軟件的交集和調(diào)控關(guān)系。網(wǎng)址：/（3）Tarbase：一個收集已被實驗驗證的microRNA靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫。網(wǎng)址：http:/microrna.gr/tarbase/（4）miRecords：一個整合的microRNA靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫。整合多個靶標(biāo)預(yù)測軟件的調(diào)控關(guān)系。網(wǎng)址：/（5）targetScan: 基于靶mRNA序列的進(jìn)化保守等特征搜尋動物的microRNA靶基因。是預(yù)測microRNA靶標(biāo)假陽性率較低的軟件。而且是microRNA領(lǐng)域大牛Bartel實驗室開發(fā)的。網(wǎng)址：/（6）PicTar：基于microRNA或microRNA靶標(biāo)聯(lián)合作用等特征開發(fā)的搜尋動物的microRNA靶基因的軟件，假陽性率也較低。是microRNA領(lǐng)域大牛Rajewsky實驗室開發(fā)的。該文章位列miRNA相關(guān)文章引用Top5。網(wǎng)址：http:/pictar.mdc-berlin.de/（7）PITA：基于靶位點的可接性（target-site accessibility）和自由能預(yù)測microRNA的靶標(biāo)。是著名的生物信息學(xué)家Segal實驗室開發(fā)的。網(wǎng)址：http:/genie.weizmann.ac.il/pubs/mir07/mir07_data.html（8）RNA22：基于序列特征預(yù)測microRNA的結(jié)合位點。是幾個流行的microRNA靶標(biāo)預(yù)測軟件的其中一個。IBM公司的研究團(tuán)隊開發(fā)的。網(wǎng)址：/rna22.html（9）miRanda和microRNA.org：是著名的Memorial Sloan-Kettering 癌癥研究中心的研究人員開發(fā)的軟件和數(shù)據(jù)庫。miRanda的最新版本又叫mirSVR。網(wǎng)址：/microrna/home.do（10）MicroCosm：EMBL-EBI的Enright 實驗室開發(fā)的microRNA靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫。網(wǎng)址：http:/www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/htdocs/targets/v5/（11）miRTarBase：整合實驗證實的microRNA靶標(biāo)的數(shù)據(jù)庫。網(wǎng)址：.tw/index.html（12）miRGator v2.0：整合microRNA表達(dá)、靶標(biāo)和疾病相關(guān)信息的數(shù)據(jù)庫。網(wǎng)址：http:/mirgator