基因沉默的研究進展

基因沉默的研究進展 基因沉默的研究進展 【摘要】 基因沉默 gene silencing)是指生物體中特定基因由于種種原因不表達或者表達減少的現(xiàn)象?；虺聊l(fā)生在兩種水平上，一種是由于 dna 甲基化、異染色質化以及位置效應等引起的轉錄水平上的基因沉默；另一種是轉錄后基因沉默。 rna 干擾 (rnai)是一種新發(fā)現(xiàn)的通過 dsrna 介導的特異同源靶基因途徑， rnai 的應用有望成為一種防治疾病的新方法?！娟P鍵詞】 基因沉默；轉錄水平基因沉默；轉錄后基因沉默； rna 干擾【中圖分類號】 q78【文獻標識碼】 a【文章編號】 1007 9297(2005)03 0227 04current progress of gene silencing chen xue-mei,du xian-gang,guan peng school of basic medicine and forensicmedicine， sichuan university,ch engdu 610041， china【 abstract】 gene silencing refers to the phenomena of specific gene un-expressing， there are two kinds of gene silencingincluding transcriptional gene silencing and post-transcriptional gene silencing rna interference(rnai)is the process of post transcriptional gene silencing by which double-stranded rna (dsrna) directs sequence specific degradation of homologousmrna scientists have carried out researches on the therapy for diferent diseases by rnai technology and it will be a noveltherapy for cancer and viral diseases【 key word】 gene silencing； transcriptional gene silencing； post-transcriptional gene silencing； rna interference；基因沉默 (gene silencing)是指生物體中特定基因由于種種原因不表達或者是表達減少的現(xiàn)象?；虺聊F(xiàn)象首先在轉基因植物中發(fā)現(xiàn)，接著在線蟲、真菌、水螅、果蠅以及哺乳動物中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)。 -3 3 基因沉默主要發(fā)生在兩種情況，一種是轉錄水平上的基因沉默 (transcriptional gene silencing， tgs)，另一種是轉錄后基因沉默 (post transcriptional gene silencing,ptgs)。 rna干擾 (rna interference， rnai)是近幾年發(fā)展起來的轉錄后基因阻斷技術 rnai 在 2002 年被 science 評為全球十大科技突破之一作為一種在細胞水平的基因敲除工具， rnai 正在功能基因組學領域掀起一場革命。一、基因沉默的分類及其機制 (一 )轉錄水平基因沉默轉錄水平基因沉默是指對基因專一的細胞核 rna 合成的失活它的發(fā)生主要是由于基因無法被順利轉錄成相應的 rna 而導致基因沉默。轉錄水平基因沉默可以通過有性世代傳遞，表現(xiàn)為減數(shù)分裂的可遺傳性。引起轉錄水平基因沉默的機制主要有 以下幾種： 1基因及其啟動子甲基化甲基化是活體細胞中最常見的一種 dna 共價修 作者簡介 陳雪梅 (1979 一 )，女，漢族，四川省峨嵋山市人，現(xiàn)在四川大學華西醫(yī)科大就讀碩士。研究方向：閉合性顱腦損傷中腦紅蛋白的表達。e mail： ameychenx163 corn【通訊作者 官鵬，男，四川大學基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院副教授， e mail： guanpengcnhotmail corn|i本課題受國家自然科學基金資助 (基金編號 30470660)及四川大學科技創(chuàng)新基金資助 (基金編號 2004cf08) 228 飾形式， 通常發(fā)生在dna 的 cg 序列的堿基上，該區(qū)堿基甲基化往往導致轉錄受抑制。該區(qū)甲基化的頻率在人 類及高等植物中分別可達 4和 36。 42 近來的研究表明。發(fā)生在轉基因啟動子 5 端的甲基化是造成轉錄水平基因沉默的主要原因。雖然轉基因的甲基化可延伸至轉基因的 3 端。但甲基化過程均是從啟動子區(qū)域開始的。從所報道的轉基因沉默例子來看，幾乎所有的轉基因沉默現(xiàn)象與轉基因及其啟動子的甲基化有關。 2同源基因間的反式失活反式失活主要是由于擁有同源序列的沉默位點和其他位點的 dna 的相互作用而引起的基因沉默。通過順式作用 而甲基化并失活的基因能作為一種 “ 沉默子 ” ，對其他與之分離的具有同源性的靶基因施加一種反式作用。使具有同源序列的靶基因發(fā)生甲基化并導致失活。反式失活的靶基因既可以與沉默基因是等位基因，也可以是非等位基因。 3后成修飾作用導致的基因沉默后成修飾作用(epigenetic effect)是指轉基因的序列和堿基組成不發(fā)生改變，但是其功能卻在個體發(fā)育的某一階段受到細胞內因子的修飾作用后而關閉。這種修飾作用所造成的轉基因沉默是可以隨著修飾作用的解除而被消除。后成修飾作用導致的轉基因沉默與受體植物的核型構成有關。 4重復 序列外源基因如果以多拷貝形式整合到同一位點上形成首尾相連的正向重復或頭對頭、尾對尾的反向重復，則不能表達，而且拷貝數(shù)越多，基因沉默現(xiàn)象越嚴重。這種重復序列誘導的基因沉默與在真菌中發(fā)現(xiàn)的重復序列誘導的點突變相類似，均可能是重復序列間自發(fā)配對，甲基化酶特異性識別這種配對結構而使其甲基化。從而抑制其表達。 5位置效應位置效應是指基因在基因組中的位置對其表達的影響。當外源基因整合到高度甲基化、轉錄活性低的異染色質區(qū)域時。外源基因一般表現(xiàn)沉默，這說明毗鄰 dna 的甲基化和異染色質化對插入的外源基因影響很大，可能導致外 源基因在轉錄水平上失活。如果轉基因插入轉錄不活躍區(qū)域或異染色質區(qū)域轉基因通常會融人該區(qū)域的染色質結構，使轉基因進行很低水平的轉錄，或使轉基因發(fā)生異染色質化而導致轉基因沉默。 (二 )轉錄后水平基因沉默轉錄后水平基因沉默是指基因在細胞核內能穩(wěn)法律與醫(yī)學雜志 2005 年第 l2 卷 (第 3 期 )定轉錄，但在細胞質里卻無相應穩(wěn)定態(tài) mrna 存在的現(xiàn)象。與轉錄水平基因沉默不同，轉錄后水平基因沉默具有逆轉性，即受抑制基因通過減數(shù)分裂可以恢復表達活性。表現(xiàn)為減數(shù)分裂不可遺傳性。目前發(fā)現(xiàn)主要有以下幾種轉錄后水平基因沉默現(xiàn)象。 1共抑制 共抑制是最常見的轉錄后水平基因沉默。這一現(xiàn)象首先由napoliul 在轉 chs 基因的矮牽?；ㄖ邪l(fā)現(xiàn)。共抑制現(xiàn)象普遍存在于轉基因植物中。共抑制的發(fā)生是由于外源基因編碼區(qū)與受體細胞基因間存在同源性而導致外源基因與內源基因的表達同時受到抑制。具有同源性的外基因和內源基因在細胞核內的轉錄速率很高，但在細胞質內無 mrna 積累。是典型的轉錄后水平基因沉默。若導入的外源基因與內源基因無序列同源性，外源基因自身也常常會發(fā)生轉錄后水平基因沉默。有關研究發(fā)現(xiàn)。共抑制的產生不僅同內、外源基因間編碼區(qū)的同源性有關。還與控制外源基因的 啟動子的強度等因素有關。 2基因壓制 cogoni 等 在粗糙脈抱霉的轉化實驗中發(fā)現(xiàn)。外源基因可以抑制自身和相應內源基因的表達。他們把這一現(xiàn)象定為基因壓制。cogoni 等是以類胡蘿卜素生物合成基因 albino l 作為視覺報道基因來研究基因壓制的。他們發(fā)現(xiàn)，基因壓制是可逆的，而且這種逆轉會伴隨有外源拷貝的丟失。基因壓制發(fā)生在轉錄后水平，導致已復制的穩(wěn)定態(tài) mrna 大量減少。 3 rna 干擾 rna 干擾是 1998 年 fire 首次在秀麗線蟲中發(fā)現(xiàn)并證明屬于轉錄后水平的基因沉默。 6利用小片段雙鏈 rna 可以特異性地降解相應序 列的 mrna。從而特異性地阻斷相應基因的表達。 rna 干擾廣泛存在于從真菌到植物、從無脊椎動物到哺乳動物的各種生物中。 rnai 的作用機制目前尚不完全清楚，學者們在線蟲、果蠅、植物和動物卵細胞的 rnai 實驗中，最近相繼發(fā)現(xiàn)了一些與 rnai 作用相關的酶和蛋白，如 dsr na 特異性核酸內切酶 (dsrna specific endonuclease， dicer)、 rna 依賴性 rna 聚合酶 (rna dependentrna polymerase， rdrp)、 argonaute 蛋白等?，F(xiàn)已初步闡明 rnai 的作用機制 如下：各種 dsrna 通過各種轉染技術轉入細胞內，較長 dsrna 被 dicer 的 rna 酶 樣特異性核酸內切酶切割產生 21 23nt 的小干擾 rna (small interfering rna sirna )，sirna 兩條單鏈末端為 5 一磷酸和 3 一羥基且 3 端都有 2 3 個突出的核苷酸。核酸內外切酶、 atp、解旋酶與 arg 法律與醫(yī)學雜志2005年第 12卷 (第 3期 )onaute蛋白相連進而與 sirna一起形成具有多個亞單元的 rna 誘導的沉默復合體 (rna induced silenc ing complex， risc)。 risc 中的解旋酶應用 atp 解開 sirna 雙鏈，使其反義鏈互補結合到靶向的 mrna 上與之相匹配的特異性序列， risc 中的核酸酶降解 mrna，從而使目的基因沉默，產生 rnai 現(xiàn)象。 sirna也能與 risc 和 mrna 聯(lián)系在一起，在解開 sirna 的雙鏈后，反義 rna鏈能作為雙鏈 rna 合成的一個引物以 mrna 為模板在 risc 中的 rdrp的作用下形成新的 dsrna，再次被 dicer 識別并切斷，形成新的 sirna再循環(huán)，作用于另外的靶向 mrna。這種不斷放大的瀑布式作用形成大量新的 sirna，使 sirna 在短時間內迅速并有效地抑制 mrna 翻譯形成蛋白質或多肽，從而有效地抑制靶向基因蛋白質或多肽的合成。二、基因沉默的相關實驗技術及其進展目前在基因沉默中主要是 rna干擾的實驗技術應用較多，根據(jù)靶 dsrna 合成的方法可將 rnai 技術分為 3 種。 1體外化學合成法最為經典的方法，共分 4 個步驟： (1)化學合成 dsrna； (2)將 dsrna 導人宿主細胞； (3)檢測靶基因抑制效率； (4)功能研究。其中， dsrna 合成成本很高， dsrna 轉人宿主細胞效率及其在宿主細胞中的穩(wěn)定性均不確定。 2體外轉錄法這種方法采用 t7rna 聚合酶 以先合成的 dna 鏈為模板反轉錄合成 dsrna，從而使合成 dbrna 的成本大大降低，但這種方法與化學合成法有相同的缺點。 3體內載體合成法這是近年來迅速發(fā)展起來，克服了前兩種方法缺點的新技術。它是 2002 年 paddison 等首先報道的利用載體在細胞體內穩(wěn)定地表達 sirna從而抑制哺乳動物細胞靶基因表達的方法。 其基本思路如下：細胞內存在 rnaplymerasein，它可以識別u6 啟動子，從而使啟動子后的基因轉錄成 rna。當模板連續(xù)出現(xiàn) 35個 “t” 堿基時，轉錄就會終止。根據(jù)這一機制，可以設計一種能表達 rna 的質粒，其組成包括 4 部分： (1)常用質粒的基本序列； (2)u6啟動子，位于克隆位點的上游； (3)克隆位點； (4)rnai模板序列 (dna)。這部分序列具有如下特點：含 rnai 序列對哺乳動物而言，通常為21 23 個核苷酸；發(fā)夾結構環(huán)狀部分通常有 47 個核苷酸；靶序列的反向互補序列： 3 5 個核 229 苷酸 “t” 。將具有如上結構的質粒導人細胞內，體內的 rnaplymerase1i就可以合成一條 rna鏈，這條 rna 鏈可以通過兩端的 21 個左右的核苷 酸反向互補特性而形成發(fā)夾樣雙鏈結構，從而起到基因抑制作用。這種技術操作簡便，成本低，與直接導人 sirna 相比， dna 質粒更易導入細胞內，而且質粒導人細胞后存在時間長且穩(wěn)定，對靶基因的表達抑制效率高，便于進行較長時間的基因功能研究，因而成為一種熱門技術。近年來多位作者幾乎同時報道了利用上述載體技術成功地抑制哺乳動物細胞基因表達的實驗。 lo 除質粒載體外，現(xiàn)已有成功地采用逆轉錄病毒載體和腺病毒載體將表達 sirna的 dna模板序列轉移入哺乳動物細胞的報道。三、基因沉默的應用前景 1抗腫瘤策略 rnai 具有特異 、高效的特點因此可用于一些腫瘤的治療。最近 lin 等把針對 bcl2 基因的 mrnacdna 雜交體轉染到人前列腺癌細胞中，產生長時期阻抑表達效應，此效應與體外培養(yǎng)的前列腺癌細胞中的 rnai 相似，進而說明哺乳動物中可以發(fā)生 rnai。 】 milner 教授應用 rnai 技術特異性地成功沉默了感染 hpv 的宮頸癌細胞中的 hpv 基因宮頸細胞內的 v53 和 rb 蛋白恢復正常功能從而恢復了宮頸細胞內正常的防御功能，使已感染 hpv 的宮頸癌細胞遭遇自殺，而對其他健康細胞的正常生長和生物學行為無影響。可以預見此技術也可應用于與 hbv 感染相關的肝細胞性肝癌的基因治療。有學者認為，應用 rnai 技術抑制腫瘤細胞中血管生長因子如血管生成素 an gil、 angi2、 angi3 及vegf 等或其受體的表達以及抑制腫瘤細胞中如癌基因 bcl2、 ras、p53 等突變基因及其蛋白的表達而不影響非突變基因的表達可達到很好的抗腫瘤生長及抗腫瘤轉移的目的。 2抗病毒斯坦福醫(yī)學院的研究者把 dsrna 放進小鼠的肝細胞， dsrna 被小鼠體內的核酸酶分解成許多 sirna，研究發(fā)現(xiàn) sirna 具有高度專一性。會與小鼠體內的丙型肝炎病毒的 mrna 相結合，使 mrna 分 解并失去翻譯蛋白質的功能。斯坦福醫(yī)學院運用此技術來治療丙型肝炎的研究，已從體外試管實驗階段推進至體內的動物實驗，且在小鼠身上，看到丙型肝炎病毒被阻斷的明顯效果。 _】 有學者認為， rnai 技術用于乙型肝炎的治療有望成為乙型肝炎治療的革命性的新方法。將具有巨大的社會價值。 hiv利用細胞表面的蛋白質進入細胞。并且感染細胞。研究人員用 dsrna關閉制造這種蛋白質必需的基因，理論上， hiv 就無法進入細胞。capodici 等應用 21bp rna 介導的 rna 干擾特異性地抑制了永生細胞系和初級 cd4+t淋巴細胞的 hiv的感染。并通過 p24葡糖胺聚糖蛋白、rna 印跡分析和反轉錄產物的 dna pcr 檢測了 hiv 復制的抑制。 13對于已經感染了 hiv 的細胞， coburn 等演證了與 hiv21 編碼特有的hiv21 反式激活蛋白和病毒粒子蛋白表現(xiàn)的調控子靶向相反的 sirna能特異性地阻斷其表達， 14 進而阻斷了 hiv 的細胞毒作用和復制。麻省理工學院的 sharp 認為，只要克服許多障礙，這個方法就可以成為治療艾滋病的基礎。 3 rnai 技術在功能基因組中的應用人類已進入后基因組計劃研究蛋白質組學。在功能基因組研究中，需要對特定基 因進行功能喪失或降低突變，以確定其功能。由于 rnai 具有高度的序列專一性，可以特異地使特定基因沉默，獲得功能喪失或降低突變，因此 rnai 可以作為一種強有力的研究工具用于功能基因組的研究。 andrew 等用可分泌 dsrna 的細菌喂養(yǎng)新小桿線蟲，研究了染色體 1 約 90的預言基因， 13 9的基因與其功能對應起來，使已知表型的基因數(shù)目由 7o 增至 378，這種方法與經典基因篩選方法相比各有千秋，但它主要的一個優(yōu)點是逆基因分析，即已知特定的基因或基因序列，通過阻抑這一特異基因的表達而出現(xiàn)功能或個體表型的改變，進而得到基 因與其功能的相應聯(lián)系。加州理工大學的 chuang使用 rnai 研究了擬南芥的 4 個開花相關基因，結果表明用 rnai 技術可以產生功能喪失或降低突變體，而且為特異性基因治療提供了新的技術手段。這使得 sirna 在科研、治療乃至商業(yè)上均有著巨大的應用前景。 4 rnai 技術在法醫(yī)學中的應用基因沉默在法醫(yī)學中也有廣泛的應用前景。法醫(yī)學的基礎研究領域中還面臨許多問題至今還未能很好解決，如腦損傷機制的研究、猝死疾病機制的研究、基因表達、成癮機制的研究等， rnai 給我們提供了新的思路。 rnai 技術在法醫(yī)學中的應用能為法醫(yī)學的基礎 研究帶來新的飛躍總之，基因沉默是基因表達調控的一種重要方式，是生物體在基因調控水平上的一種自我保護機制，對基因沉默進行深入研究可幫助人們進一步揭示生物體基因遺傳表達調控的本質。 rnai 在許多領域具有廣泛的應用前景。在基因工程中克服基因沉默現(xiàn)法律與醫(yī)學雜志 2005 年第 l2 卷 (第 3 期 )象。從而使少量基因能更好按人們的需要進行有效表達：利用基因沉默在基因治療中有效抑制有害基因的表達，可達到治療疾病的目的；15利用基因沉默中的一些基因沉默現(xiàn)象解決一些法醫(yī)鑒定方面的難題。因此，研究基因沉默具有重要的理論和實踐意義 。參考文獻 1 napoli c， lemieux cjorgensen r introduction of a chimeric chalconesynthase gene into petunia results in reversible co-suppressionof homologous 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