細(xì)胞培養(yǎng)PPT.ppt

細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù) 細(xì)胞培養(yǎng)的基本概念 傳代 細(xì)胞在培養(yǎng)器皿中生長一定時間后 被分開接種到新的培養(yǎng)器皿中 原代培養(yǎng)取自體內(nèi)新鮮組織并置于體外條件下生長的細(xì)胞在傳代之前稱為原代培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng) 使用單個細(xì)胞懸液組織培養(yǎng) 使用組織塊 O 5 1立方毫米 或薄片 厚0 2毫米 器官培養(yǎng) 使用器官原基或器官的一部分或整個器宮 原代培養(yǎng)細(xì)胞的生命歸宿 原代培養(yǎng)期傳代期衰退期 有限細(xì)胞系 無限細(xì)胞系細(xì)胞系cellline細(xì)胞株cellstrain 培養(yǎng)細(xì)胞的特性 培養(yǎng)細(xì)胞的生長方式貼附生長 必須貼附于支持物表面才能生長 見于各種實體瘤細(xì)胞懸浮生長 于懸浮狀態(tài)下即可生長 不需要貼附于支持物表面 見于各種造血系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞 每代貼附生長細(xì)胞的生長過程 游離期貼壁期潛伏期對數(shù)生長期停止期 平臺期 游離期 細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài) 也稱懸浮期 此時細(xì)胞質(zhì)回縮 胞體呈圓球形 10分鐘一4小時 貼壁期 細(xì)胞附著于底物上 游離期結(jié)束 細(xì)胞株平均在10分鐘一4小時貼壁 底物 膠原 玻璃 塑料 其它細(xì)胞等血清中有促使細(xì)胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素 膠原等糖蛋白 生長基質(zhì) 這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物上 懸浮細(xì)胞再與吸附有促貼壁因子的附著 進口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長基質(zhì) 化學(xué)合成的功能基團 潛伏期此時細(xì)胞有生長話動 而無細(xì)胞分裂 細(xì)胞株潛伏期一般為6 24小時 對數(shù)生長期 細(xì)胞數(shù)隨時間變化成倍增長 活力最佳 最適合進行實驗研究 停止期 平臺期 細(xì)胞長滿瓶壁后 細(xì)胞雖有活力但不再分裂機制 接觸抑制 密度依賴性 培養(yǎng)細(xì)胞生長的條件 1細(xì)胞的營養(yǎng)需要2細(xì)胞的生存環(huán)境溫度 37 O2CO2 5 CO2 H2O H2CO3 H HCO3 pH 7 2 7 4滲透壓3無污染4無毒 實驗準(zhǔn)備 實驗用品 超凈工作臺 壓力蒸汽消毒器 電熱干燥箱 濾器 酸缸CO2培養(yǎng)箱倒置顯微鏡酶標(biāo)儀 微孔板震蕩器液氮罐自動雙重純水蒸餾器 純水儀耗材 培養(yǎng)瓶 吸管 電動吸引器 培養(yǎng)板 凍存管 壓力蒸汽消毒器 濕熱消毒 用途廣電熱干燥箱 干熱消毒 160 2小時 主要用干玻璃器皿消毒濾器 過濾除菌 大多數(shù)培養(yǎng)用液 如人工合成培養(yǎng)基 血清 酶液等均采用濾過法除菌超凈工作臺 為細(xì)胞操作提供無菌環(huán)境紫外燈 紫外線消毒 主要用于培養(yǎng)室空氣 操作臺 塑料培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒 超凈臺 超凈工作臺的工作原理是利用鼓風(fēng)機驅(qū)動空氣遁過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒 使空氣得到凈化 凈化空氣徐徐通過工作臺面 使工作臺內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境 濾器 CO2培養(yǎng)箱 CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37 5 CO2 使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時應(yīng)注意的問題 用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時 需將瓶蓋微松 以保證通氣 保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈 定期消毒 90 14h 箱內(nèi)火菌蒸餾水3000毫升蒸餾水槽中以保持箱內(nèi)濕度 避兔培養(yǎng)液蒸發(fā) 自動雙重純水蒸餾器純水儀 酶標(biāo)儀微孔板震蕩器 培養(yǎng)板 培養(yǎng)瓶 常用玻璃器皿清洗浸泡 自來水 刷洗 洗衣粉 酸泡 24小時 流水沖洗 蒸溜水浸泡和沖洗 50 烘干 清潔液的配制 2細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制水 新鮮配置的三蒸水或去離子水平衡鹽溶液 無Ca2 Mg2 的緩沖液PBS NaCl8 0gKCl0 2gNa2HPO4 H2O1 56gKH2PO40 20加水至1000ml 消化液 胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健 除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白 影響細(xì)胞骨架 從而使細(xì)胞分離 胰蛋白酶液濃度越高 作用越強 但超過一定限度會損傷細(xì)胞 胰蛋白酶是一種黃白色粉末 用無Ca2 Mg2 的PBS緩沖液配制常用的胰蛋白酶液濃度是0 25 用濾器過濾除菌 胰蛋白酶液消化時間 2 10分鐘 用含血清培養(yǎng)液終止其對細(xì)胞的消化作用 培養(yǎng)基 培養(yǎng)基 培養(yǎng)液 是維持體外細(xì)胞生存和生長的溶液 分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基 天然培養(yǎng)基 天然培養(yǎng)基有血清 血漿 和組織提取液 如雞胚和牛胚浸液 優(yōu)點 營養(yǎng)成分豐富 培養(yǎng)效果好缺點 來源受限 成分復(fù)雜 影響對某些實驗產(chǎn)物的提取和實驗結(jié)果的分析 易發(fā)生支原體污染 合成培養(yǎng)基 合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量 用人工方法模擬合成的 目前已設(shè)計出許多種培養(yǎng)基 如TC199 MEM RPMI 1640 DMEM等 合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸 維生素 碳水化合物 無機鹽和其它一些輔助物質(zhì) 優(yōu)點 標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn) 組分和含量相對固定 成本低缺點 缺少某些成分 不能完全滿足體外細(xì)胞生長需要 人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存 要想使細(xì)胞生長和繁殖 還需補充一定量的天然培養(yǎng)基 如血清 血清中含有 多種蛋白質(zhì) 白蛋白 球蛋白 鐵蛋白等 多種金屬離子 激素 促貼附物質(zhì) 如纖粘蛋白 冷析球蛋白 膠原等 各種生長因子 轉(zhuǎn)移蛋白 不明成分 一般說來 含5 小牛血清的培養(yǎng)基對大多數(shù)細(xì)胞可以維持細(xì)胞不死 但支持細(xì)胞生長一般需加10 血清 對于血清支持細(xì)因生長的生物學(xué)效應(yīng)已得到證明 但對血清中的復(fù)雜成分至今尚未完全清楚 血清中不僅存在促細(xì)胞生長因子 同對也存在細(xì)胞生長抑制因子或毒性因子 因此在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞所反映的生物學(xué)特性是細(xì)胞和復(fù)雜血清因子的綜合反應(yīng) 在生長因子 蛋白質(zhì)工程 基因表達調(diào)控等研究領(lǐng)域 迫切需要用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞 無血清培養(yǎng)基的主要研制策略 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補充各種必需因子 如激素 生長因子 結(jié)合蛋白 貼壁和擴展因子等 無血清培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和替代血清的補充成分組成 1975年 Sato首次成功地用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)了垂體細(xì)胞株 近20多年來已報道了幾十種細(xì)胞系在無血清培養(yǎng)基中成功地生長和增殖 無血清細(xì)胞培養(yǎng)基的使用保證了實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性 可重復(fù)性和穩(wěn)定性 減少了細(xì)胞污染 簡化了提純和鑒定各種細(xì)胞產(chǎn)物的程序 向無清培養(yǎng)液中能促進細(xì)胞系生長的補加物都是獨特的 適用于某種細(xì)胞株的培養(yǎng)液 很可能不適合另一種細(xì)胞株的生長 即使同源組織的不同細(xì)胞株 所需補加物也不同 無血清培養(yǎng)基尚處于研究階段 難以推廣 目前 絕大多數(shù)人工合成培養(yǎng)基使用時還需添加血清 血清質(zhì)量好壞是實驗成敗的關(guān)鍵 常用血清有胎牛血潔 新生牛血清 小牛血情 兔血清 馬血清等 其中以胎牛血清質(zhì)量最好 優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn) 透明 淡黃色 無沉淀物 無細(xì)菌 支原體 病毒污染 血清的滅活 消除補體活性 56 30分鐘血清的消毒 過濾除菌 抗菌素的使用 在培養(yǎng)液配制后 培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素 以抑制可能存在的細(xì)菌的生長 通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用 培養(yǎng)基內(nèi)青霉素 鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位 慶大霉素 每毫升100單位 方便 廣譜 穩(wěn)定 完全培養(yǎng)基的組成 基礎(chǔ)培養(yǎng)基80 一95 血清5 一20 碳酸氫鈉2 0g L青 鏈霉素各100卑位 毫升 培養(yǎng)基的配制 RPMI 1640培養(yǎng)粉1袋碳酸氫鈉2 0g青 鏈霉素各100單位 毫升加三蒸水至1000ml 過濾除菌 調(diào)節(jié)pH值至7 2加血清 終濃度10 細(xì)胞傳代方法 根據(jù)細(xì)胞生長的恃點 傳代方法有3種 1懸浮生長細(xì)胞傳代離心法傳代 離心 1000轉(zhuǎn) 分 去上清 沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代 直接傳代法 懸浮細(xì)胞沉淀在瓶壁時 將上清培養(yǎng)液去除l 2一2 3 然后用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代 2半懸浮生長細(xì)胞傳代 Hela細(xì)胞 此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象 但貼壁不牢 可用直接吹打法使紉胞從瓶壁脫落下來 進行傳代 3貼壁生長細(xì)胞傳代采用酶消化法傳代 常用的消化液有0 25 的胰蛋白酶液 貼壁生長細(xì)胞傳代方法 1吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液2加入1 2ml0 25 的胰蛋白酶液 以消化液能覆蓋整個瓶底為準(zhǔn) 靜置2 10min 顯微鏡下動態(tài)監(jiān)測 3吸去胰蛋白酶液 加入培養(yǎng)液 4用吸管吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液 反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞 形成細(xì)胞懸液 5吸取1 10 1 40細(xì)胞懸液 接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi) 6加適量新鮮培養(yǎng)液于接種了細(xì)胞懸液的新培養(yǎng)瓶內(nèi) 7將后者放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 細(xì)胞計數(shù) 血細(xì)胞計數(shù)器 手工計數(shù)細(xì)胞Coulter計數(shù)儀 人工計數(shù) 培養(yǎng)細(xì)胞活力測定 細(xì)胞活力測定是腫瘤體外研究中應(yīng)用最廣的技術(shù)手段之一 任何培養(yǎng)瓶內(nèi)生長的細(xì)胞都由死細(xì)胞和活細(xì)胞組成 從形態(tài)上區(qū)別死 活細(xì)胞是困難的 1細(xì)胞克隆形成率實驗單個細(xì)胞在體外增殖6代以上 其后代所組成的細(xì)胞群體形成肉眼可見的克隆 克隆形成卒用來表示細(xì)胞的增殖能力克隆形成率比 克隆形成數(shù) 接種細(xì)胞數(shù)缺點 操作繁瑣優(yōu)點 精確 可靠 2臺盼藍法 活細(xì)胞不被染色 死細(xì)胞染成藍色 用活細(xì)胞占細(xì)胞中的百分比表示細(xì)胞恬力已淘汰 3四唑鹽 MTT 比色法 四唑鹽 MTT 商品名為噻唑藍 四吐鹽比色法的原理 活細(xì)胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍紫色產(chǎn)物 formazan 并沉淀在細(xì)胞中 而死細(xì)胞沒有這種功能 二甲亞砜 DMSO 能溶解沉積在細(xì)胞中藍紫色結(jié)晶物 溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比 再用酶標(biāo)儀測定OD值MTT法簡單快速 準(zhǔn)確 廣泛應(yīng)用于新藥篩選 細(xì)胞毒牲試驗 腫瘤放射敏感性實驗等 操作步驟 1 單細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板 103 104細(xì)胞 孔 每孔培養(yǎng)基總量200微升 96孔培養(yǎng)板每孔容積370微升 37 5 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時間 根據(jù)實驗?zāi)康臎Q定培養(yǎng)時間 2 加入2毫克 毫升的MTT液 50微升 孔 繼續(xù)培養(yǎng)3小時 3 吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后 加入DMSO液 150微升 孔 將培養(yǎng)板置于微孔板扳蕩器上振蕩10分鐘 使結(jié)晶物溶解 4 酶標(biāo)儀檢測各孔OD值 檢測波長570納米 記錄結(jié)果 繪制 操作步驟 1 單細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板 103 104細(xì)胞 孔 每孔培養(yǎng)基總量200微升 96孔培養(yǎng)板每孔容積370微升 37 5 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時間 根據(jù)實驗?zāi)康臎Q定培養(yǎng)時間 2 加入2毫克 毫升的MTT液 50微升 孔 繼續(xù)培養(yǎng)3小時 3 吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后 加入DMSO液 150微升 孔 將培養(yǎng)板置于微孔板扳蕩器上振蕩10分鐘 使結(jié)晶物溶解 4 酶標(biāo)儀檢測各孔OD值 檢測波長為570nm 記錄結(jié)果 繪制細(xì)胞生長曲線 細(xì)胞凍存和復(fù)蘇 細(xì)胞低溫冷凍貯存是細(xì)胞室的常規(guī)工作 細(xì)胞凍存與細(xì)胞傳代保存相比可以減少入力 經(jīng)費 減少污染 減少細(xì)胞生物學(xué)特性變化 凍存和復(fù)蘇的原則 慢凍快融 當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下 可以產(chǎn)生以下變化 細(xì)胞器脫水 細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高 并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶 如果緩慢冷凍 可使細(xì)胞逐步脫水 細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶 相反 結(jié)晶就大 大結(jié)晶會造成細(xì)胞膜 綱胞器的損傷和破裂 復(fù)蘇過程應(yīng)快融 目的是防止小冰晶形成大冰晶 即冰晶的重結(jié)晶 慢凍程序 標(biāo)準(zhǔn)程序 當(dāng)溫度在 25 以上時 1 2 min當(dāng)溫度達 25 以下時 5 10 min當(dāng)溫度達 100 時 可迅速放入液氮中細(xì)胞凍存器簡易程序 將冷凍管 管口要朝上 放入紗布袋內(nèi) 紗布袋系以線繩 通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口 按每分鐘溫度下降1 2 的速度 在40分鐘內(nèi)降至液氮表面 停30分鐘后 直接投人液氮中 低溫保護劑的應(yīng)用 在細(xì)胞凍存時加入溫保護劑 能大大提高凍存效果 常用的低溫保護劑是DMSO 它是一種滲透性保護劑 可迅速透入細(xì)胞 提高胞膜對水的通透性 降低冰點 延緩凍結(jié)過程 能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外 在胞外形成冰晶 減少胞內(nèi)冰晶 從而減少冰晶對細(xì)胞的損傷 細(xì)胞凍存方法 1預(yù)先配制凍存液 含20 血清培養(yǎng)基