化學(xué)發(fā)光法的原理技術(shù)要點(diǎn)及評(píng)價(jià)應(yīng)用.ppt

化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù) 第一節(jié)發(fā)光與化學(xué)發(fā)光劑第二節(jié)發(fā)光酶免疫測(cè)定 CLEIA chemiluminescenceenzymeimmunoasssay 第三節(jié)化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定技術(shù) CLIA chemiluminescenceimmunoassay 第四章電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定技術(shù) ECLI electrochemiluminescenceimmunoassay 化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù) 集靈敏的化學(xué)發(fā)光分析和特異的抗原抗體免疫測(cè)定于一體的檢測(cè)技術(shù) 概念 特點(diǎn) 特異性高 敏感性高 分離簡(jiǎn)便 快速 試劑無(wú)毒 安全穩(wěn)定 可自動(dòng)化 化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的類型 按發(fā)光劑不同分為1 發(fā)光酶免疫測(cè)定 CLEIA chemiluminescenceenzymeimmunoasssay2 化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定技術(shù) CLIA chemiluminescenceimmunoassay3 電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定技術(shù) ECLI electrochemiluminescenceimmunoassay按分離方法不同分1 微粒子化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定2 磁顆?；瘜W(xué)發(fā)光免疫測(cè)定 第一節(jié)發(fā)光與化學(xué)發(fā)光劑 一 發(fā)光一種物質(zhì)由電子激發(fā)態(tài)回復(fù)到基態(tài)時(shí) 釋放出的能量表現(xiàn)為光的發(fā)射 1 光照發(fā)光 發(fā)光劑經(jīng)短波長(zhǎng)入射光照射后進(jìn)入激發(fā)態(tài) 當(dāng)回復(fù)至基態(tài)時(shí)發(fā)出較長(zhǎng)波長(zhǎng)的可見(jiàn)光 2 生物發(fā)光 反應(yīng)底物在熒光素酶的催化下利用ATP產(chǎn)能 生成激發(fā)態(tài)的氧化熒光素 后者在回復(fù)到基態(tài)時(shí)多余的能量以光子形式放出 3 化學(xué)發(fā)光 在常溫下由化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的光的發(fā)射 化學(xué)發(fā)光是一個(gè)多步驟的過(guò)程 熒光素酶ATP O2 Mg2 氧化螢火蟲(chóng)熒光素 螢火蟲(chóng)熒光素 生物發(fā)光 返回 光 AMP O2 CO2 化學(xué)發(fā)光 機(jī)制 某些化合物可以利用化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的能量使其產(chǎn)物分子或反應(yīng)中間態(tài)分子上升至電子激發(fā)態(tài) 當(dāng)此產(chǎn)物分子或中間態(tài)分子衰退至基態(tài)時(shí) 以發(fā)射光子的形式釋放能量 即發(fā)光 二 化學(xué)發(fā)光劑 化學(xué)發(fā)光劑或發(fā)光底物 在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中參與能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光子的形式釋放能量的化合物 發(fā)光劑分為熒光素 生物發(fā)光劑 化學(xué)發(fā)光劑 能參與化學(xué)發(fā)光反應(yīng) 與抗原或抗體偶聯(lián)后形成穩(wěn)定的結(jié)合物試劑 偶聯(lián)后仍保留高的量子效應(yīng)和反應(yīng)動(dòng)力 應(yīng)不改變或極少改變被標(biāo)記物的理化特性 特別是免疫活性 化學(xué)發(fā)光劑應(yīng)符合以下幾個(gè)條件 返回 1 酶促反應(yīng)的發(fā)光底物 是指經(jīng)酶的降解作用而發(fā)出光的一類發(fā)光底物 CLEIA中常用的酶有HRP和APHRP的發(fā)光底物有魯米諾 對(duì) 羥基苯乙酸AP的發(fā)光底物有AMPPD 4 MUP 熒光底物 特點(diǎn) 可作標(biāo)記物 也可作過(guò)氧化物酶的底物 1 1魯米諾 H2O2 OH HRP N2 H2O 光 對(duì) 羥基苯乙酸 HPA HPA在H2O2存在下被HRP氧化成氧化二聚體 熒光物質(zhì) 在350nm激發(fā)光作用下 發(fā)出450nm波長(zhǎng)的熒光 可用熒光光度計(jì)測(cè)量 1 2HPA H2O2HRP 熒光 氧化二聚體 AMPPD AMPPD在堿性條件下 被AP酶解生成相當(dāng)穩(wěn)定的AMP D陰離子 其有2 30min的分解半衰期 發(fā)出波長(zhǎng)為470nm的持續(xù)性光 在15min時(shí)其強(qiáng)度達(dá)到高峰 15 60min內(nèi)光強(qiáng)度保持相對(duì)穩(wěn)定 光 AP OH HPO42 1 3AMPPD 4 MUP 4 MUP被AP催化生成4 甲基傘形酮 在360nm的激發(fā)光的作用下 發(fā)出448nm的熒光 可用熒光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)量 熒光 AP 1 44 MUP 4 MU 360nm激發(fā)光 H3PO4 2 直接化學(xué)發(fā)光劑 特點(diǎn) 不需催化劑 只需改變?nèi)芤旱膒H等條件就能發(fā)光的物質(zhì) 反應(yīng)迅速 背景低 信比高 發(fā)光量與AE濃度呈線性關(guān)系 常用試劑 吖啶酯 acridinium AE CO2 光 3 電化學(xué)發(fā)光劑 是指通過(guò)在電極表面進(jìn)行電化學(xué)反應(yīng)而發(fā)出光的物質(zhì) 特點(diǎn) 反應(yīng)在電極進(jìn)行 電子供體為 三丙胺 TPA 化學(xué)發(fā)光劑 三聯(lián)毗啶釕 返回 三聯(lián)毗啶釕分子結(jié)構(gòu)圖 第二節(jié)發(fā)光酶免疫測(cè)定 CLEIA 一 原理屬于酶免疫測(cè)定的一種 只是最后一步酶反應(yīng)所用底物為發(fā)光劑 通過(guò)發(fā)光反應(yīng)發(fā)出的光在特定的儀器上進(jìn)行測(cè)定 二 技術(shù)類型根據(jù)酶促反應(yīng)底物不同可分為 1 熒光酶免疫測(cè)定技術(shù)2 化學(xué)發(fā)光酶免疫測(cè)定技術(shù) 根據(jù)免疫學(xué)反應(yīng)模式分1 雙抗體夾心法和雙抗原夾心法3 固相抗原競(jìng)爭(zhēng)法 熒光酶免疫測(cè)定技術(shù)反應(yīng)原理圖 洗滌棄上清 是利用理想的酶熒光底物 生成的產(chǎn)物穩(wěn)定并有強(qiáng)的熒光強(qiáng)度 通過(guò)測(cè)定熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量 化學(xué)發(fā)光酶免疫測(cè)定技術(shù)反應(yīng)原理圖 洗滌棄上清 是利用酶對(duì)發(fā)光底物催化作用而直接發(fā)光 通過(guò)光強(qiáng)度的測(cè)定而直接進(jìn)行定量 電化學(xué)發(fā)光原理圖 這一過(guò)程可在電極表面周而復(fù)始地進(jìn)行產(chǎn)生許多光子 使光信號(hào)增強(qiáng) 返回 激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定 基態(tài) 電極 1 抗原抗體結(jié)合反應(yīng)將已包被了抗體的乳膠微粒和待測(cè)標(biāo)本加入反應(yīng)杯中 經(jīng)溫育一定時(shí)間后 再加入AP標(biāo)記抗體 溫育 形成固相包被抗體 抗原 酶標(biāo)抗體復(fù)合物 技術(shù)要點(diǎn) 2 分離技術(shù)將復(fù)合物轉(zhuǎn)移到玻璃纖維上 用緩沖液洗滌 沒(méi)結(jié)合的抗原被洗脫 酶標(biāo)抗體 抗原 膠乳微?？贵w復(fù)合物則被保留在纖維膜上 3 酶促發(fā)光反應(yīng)加入4 MUP 酶標(biāo)抗體上AP將4 MUP分解 形成4 MU 它在360nm激發(fā)光的照射下 發(fā)出448nm的熒光 經(jīng)熒光儀記錄 放大 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線由電腦計(jì)算出所測(cè)物質(zhì)的含量 1 磁顆粒分離法 用抗原或抗體包被磁顆粒 與標(biāo)本中相應(yīng)抗原或抗體和酶標(biāo)的抗體或抗原通過(guò)一定模式的免疫學(xué)反應(yīng)后 最終通過(guò)磁場(chǎng)將結(jié)合酶標(biāo)記物IC和游離酶標(biāo)記物進(jìn)行分離的技術(shù) 分離技術(shù) 2 微粒子捕獲法 所用顆粒是無(wú)磁性微粒子作為抗體或抗原的包被載體 然后用纖維膜柱子進(jìn)行酶標(biāo)記物的結(jié)合狀態(tài)和游離狀態(tài)的分離 3 包被珠分離法 用聚苯乙稀等材料制成小珠 在小珠上包被抗原或抗體 經(jīng)抗原抗體反應(yīng)后 將結(jié)合狀態(tài)和游離狀態(tài)的酶標(biāo)記物進(jìn)行分離 第三節(jié)化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定技術(shù) CLIA 一 原理用化學(xué)發(fā)光劑直接標(biāo)記抗原或抗體 與待測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)Ab或Ag 磁顆粒性的Ag或Ab反應(yīng) 通過(guò)磁場(chǎng)把結(jié)合狀態(tài) 沉淀部分 和游離狀態(tài)的化學(xué)發(fā)光劑標(biāo)記物分離開(kāi)來(lái) 然后加入發(fā)光促進(jìn)劑進(jìn)行發(fā)光反應(yīng) 通過(guò)對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的檢測(cè)進(jìn)行定量或定性檢測(cè) 二 技術(shù)類型1 分離方法常用磁顆粒分離技術(shù)2 免疫學(xué)反應(yīng)模式同酶發(fā)光免疫測(cè)定技術(shù)3 不同只是相應(yīng)標(biāo)記物是吖啶酯而不是酶 1 抗原抗體結(jié)合反應(yīng)將包被McAb的磁顆粒和待測(cè)標(biāo)本加入到反應(yīng)管中 標(biāo)本中待測(cè)Ag與磁珠上Ab結(jié)合 再加上AE標(biāo)記Ab 經(jīng)過(guò)溫育 形成磁珠Ab Ag AE標(biāo)記Ab復(fù)合物 技術(shù)要點(diǎn) 2 分離技術(shù)在電磁場(chǎng)中進(jìn)行2 3次洗滌后 很快地將未結(jié)合的多余Ag和標(biāo)記Ab洗去 3 化學(xué)發(fā)光反應(yīng)經(jīng)洗滌的磁珠中 加入H2O2和pH糾正液NaOH 這時(shí)AE不需要催化劑即分解并發(fā)光 由集光器接收 經(jīng)光電倍增管放大 記錄1S內(nèi)所產(chǎn)生的光子能 其積分與被測(cè)物含量成正比 按標(biāo)準(zhǔn)曲線 儀器可計(jì)算出被測(cè)物含量 1 AE其低背景噪音 化學(xué)反應(yīng)簡(jiǎn)單 快速而無(wú)催化劑 方法評(píng)價(jià) 2 AE與大分子的結(jié)合并無(wú)減少所產(chǎn)生的光量 從而增加靈敏度 靈敏度可達(dá)10 15g ml 3 AE標(biāo)記試劑有效期長(zhǎng) 可達(dá)一年 4 固相分離劑為極為幼細(xì)的磁粉 除增大包被面積 加快反應(yīng)外 亦同時(shí)使清洗及分離更簡(jiǎn)易 快捷 第四節(jié)電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定技術(shù) ECLI 一 原理是一種在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng) 實(shí)際上包括了電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光二個(gè)過(guò)程 ECL是電啟動(dòng)發(fā)光反應(yīng) 而CL是通過(guò)化合物混合啟動(dòng)發(fā)光反應(yīng) 用化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕 Ru bpy 3 2 標(biāo)記Ab 通過(guò)Ag Ab反應(yīng)和磁珠分離技術(shù) 根據(jù)三聯(lián)吡啶釕在電極上發(fā)出的光強(qiáng)度對(duì)待測(cè)的Ag或Ab進(jìn)行定量 定性 二 技術(shù)類型1 分離方法常用磁顆粒分離技術(shù)2 免疫學(xué)反應(yīng)模式同酶發(fā)光免疫測(cè)定技術(shù)3 相應(yīng)標(biāo)記物是三聯(lián)吡啶釕而不是酶 1 三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體和生物素標(biāo)記抗體與待測(cè)標(biāo)本同時(shí)加入一個(gè)反應(yīng)杯中孵育反應(yīng) 技術(shù)要點(diǎn) 2 將鏈霉親和素 SA 包被磁珠加入反應(yīng)杯中 再次孵育 使生物素 B 通過(guò)與親和素 A 的結(jié)合 將磁珠 Ab連接為一體 形成雙Ab夾心法 3 蠕動(dòng)泵將形成的 Ru bpy 3 2 Ab Ag Ab B SA 磁珠復(fù)合體吸入流動(dòng)測(cè)量室 磁珠被工作電極下面的磁鐵吸附于電極表面 同時(shí) 游離的Ab也被吸出測(cè)量室 4 蠕動(dòng)泵加入TPA 電極加電壓 啟動(dòng)ECL反應(yīng)過(guò)程 該過(guò)程在電極表面周而復(fù)始地進(jìn)行 產(chǎn)生許多光子 光電倍增管檢測(cè)光強(qiáng)度 其與 Ru bpy 3 2 的濃度呈線性關(guān)系 故可測(cè)出待測(cè)Ag的含量 原理圖 返回 抗體包被樣本Ru byp 2 TPA緩沖的磁珠抗原標(biāo)記抗體液洗滌 3 方法評(píng)價(jià) 標(biāo)記物的再