溶菌酶的晶體培養(yǎng)試驗(yàn).doc

溶菌酶晶體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康慕陙?lái)，X射線晶體結(jié)構(gòu)分析技術(shù)在受體研究中得到了廣泛應(yīng)用。其關(guān)鍵是獲得具有高衍射分辨率的晶體。本試驗(yàn)通過(guò)溶菌酶晶體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)：1 了解蛋白質(zhì)分子結(jié)晶的原理2 了解影響蛋白質(zhì)分子結(jié)晶的因素3 掌握蛋白質(zhì)晶體的懸滴培養(yǎng)法二 蛋白質(zhì)分子結(jié)晶的原理蛋白質(zhì)結(jié)晶的4個(gè)主要步驟：1 測(cè)定蛋白質(zhì)溶液的純度 2 蛋白質(zhì)溶液與鹽，有機(jī)化合物等沉淀劑混勻；膜蛋白需要加入去垢劑3 混合溶液達(dá)到過(guò)飽和狀態(tài)，形成晶核4 晶核一旦形成，晶體開(kāi)始生長(zhǎng)三影響蛋白質(zhì)分子結(jié)晶的因素1待結(jié)晶蛋白質(zhì)的純度，一般要求純度高于95%2待結(jié)晶蛋白質(zhì)的濃度， 510 mg/ml3沉淀劑，鹽，PEG，有機(jī)溶劑4pH值5溫度， 4C, 16C6. 結(jié)晶方法，懸滴法，坐滴法7震動(dòng)四 試劑及器材1 試劑：溶菌酶蛋白，氯化鈉，醋酸鈉，去離子水2 器材：可調(diào)移液器，晶體培養(yǎng)板，硅化蓋玻片，真空脂，晶體培養(yǎng)箱，顯微鏡五 試驗(yàn)步驟1 配制50 mg/ml 溶菌酶溶液，0.1 M醋酸鈉溶液，pH4.52 配制池液：（1）5% (w/v) 氯化鈉，0.1 M醋酸鈉溶液，pH4.5 （2）8% (w/v) 氯化鈉，0.1 M醋酸鈉溶液，pH4.53在晶體培養(yǎng)板溶劑池中分別加入0.3 ml池液（1）和池液（2）4在干凈的硅化蓋玻片上，滴加2 ml溶菌酶溶液和2 ml池液5將蓋玻片倒扣在加池液的有溶劑池上，用真空脂密封6將晶體培養(yǎng)板放入16C晶體培養(yǎng)箱7第二天，在顯微鏡下觀察晶體生長(zhǎng)情況Procedure for Crystallization of Lysozyme Chemicals needed: Lysozyme proteinSodium ChlorideSodium Acetate bufferDistilled waterProcedure1. Prepare 50 mg/ml sample of lysozyme in 0.1 M NaAc pH4.52. Prepare well solutions:a. 5% (w/v) NaCl, 0.1 M sodium acetate, pH4.5 b. 8% (w/v) NaCl, 0.1 M sodium acetate, pH4.53. Place 0.3 ml of well solution a, well solution b in each well of a VDX tray4. On a clean silated cover slide, create 4 drops of 2 l lysozyme solution, 2 l well solution5. Seal these cover slips with grease over a well6. Place the VDX plate in 16