土壤酶活性及土壤微生物計數(shù)測定方法.doc

土壤酶活性及微生物測定土壤酶活性測定取樣工具及取樣方法在選好適當?shù)攸c后，用小鏟子除去表土，取離地面5-15cm處的土約10g，盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，標記，記錄采樣時間、地點、環(huán)境條件等，以備查考。土樣在自然條件下烘干裝入袋中備用。所需試劑： 酒石酸鈉、NaCl、阿拉伯膠、納氏試劑、硫酸銨(NH4)2SO4、甲苯、苯磷酸二鈉、NaAc.3H2O、HAc、酚、鐵氰化鉀、4-氨基安替吡啉、碘化鉀、氯化汞、氫氧化鉀、配置方法：銨態(tài)氮標準溶液：稱取0.4717g(精確至0.0001g)干燥的硫酸銨(NH4)2SO4溶于水中，再加水稀釋至1000mL，此溶液1mL含100g N。往500ml容量瓶中注入10、25、40、60、75、90ml標準溶液并用蒸餾水稀釋至刻度，制備成的溶液在490nm下比色，并繪制標準曲線。醋酸緩沖液：PH5.0，NaAc.3H2O50g，溶于適量水中，加6mol/LHAc34ml，稀釋至500ml。硼酸緩沖液：PH9.0，80毫升0.05mol/l硼砂（Na2B4O7.10H2O）和0.2mol/l的硼酸混合。納氏試劑：將碘化鉀10g溶于10ml水中，邊攪拌邊慢慢地加入氯化汞飽和水溶液，直至生成的紅色沉淀不再溶解為止。加入氫氧化鉀30g并溶解之，再加入氯化汞飽和溶液1ml，加水至200ml。靜置，取上層清液，貯于棕色瓶中酚的標準溶液：（1）原液1克酚溶于蒸餾水中定容至1升，溶液在暗色中穩(wěn)定，（2）工作液取50ml原液稀釋至1升（1ml含0.05mg酚）；分別向100ml容量瓶中注入1、2、3、4、5、6、7ml工作液并顯色定容（分別相當于0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35毫克酚），待顏色穩(wěn)定后，570nm比色繪制標準曲線。測定方法磷酸酶活性測定一、 試驗原理土壤中的磷，很大部分以有機磷化合物的形式存在。磷酸酶能促進有機磷化合物的水解。實驗表明，土壤微生物對于土壤含磷有機物質(zhì)的礦化起著主要作用；土壤的磷酸酶活性，在很大程度上取決于土壤的腐殖質(zhì)含量，活性磷量，能礦化有機磷化合物的微生物數(shù)量，植物類型等因素，土壤的磷酸酶活性可以表征土壤的肥力狀況。二、 實驗儀器恒溫箱、分光光度計、三、 實驗藥品甲苯、苯磷酸二鈉、酚、醋酸緩沖液、硼酸緩沖液、鐵氰化鉀、4-氨基安替吡啉、四、 實驗步驟取5克過20目篩的風干土樣于50毫升容量瓶中，用0.8(16滴)毫升甲苯處理，15分鐘后，加入5毫升苯磷酸二鈉溶液（6.75克苯磷酸二鈉溶于水，并稀釋至1升）和5毫升相應的緩沖液（堿性磷酸酶用pH10的硼酸緩沖液，中性磷酸酶用pH7.0的檸檬酸緩沖液，酸性磷酸酶用pH5.0的醋酸緩沖液）。仔細混合后，將反應物置于37攝氏度恒溫箱中培養(yǎng)12小時，然后用蒸餾水定容至刻度，搖勻過濾，用5毫升水代替基質(zhì)以設置對照。為了測定反應混合物中的酚量，取1毫升濾液于100毫升容量瓶中，加5毫升硼酸緩沖液（pH9.0），再加入3毫升2.5%的鐵氰化鉀和3毫升0.5%的4-氨基安替吡啉，搖動，溶液呈粉紅色，然后再加水定容，待顏色褪到穩(wěn)定時（約需2030分鐘），在分光光度計上于波長570納米處測定溶液的光密度，根據(jù)用酚制備的標準曲線查出供試濾液中酚的含量。磷酸酶活性以每克土壤的酚毫克數(shù)表示。脲酶活性測定一、 試驗原理 土壤的脲酶活性，與土壤的微生物數(shù)量、有機物質(zhì)含量、全氮和速效氮含量呈正相關。根基土壤可測得最大的脲酶活性，人們常用土壤的脲酶活性表征土壤的氮素狀況。二、 實驗儀器錐形瓶、定性濾紙、震蕩器、分光光度計、1mm篩、三、 實驗藥品酒石酸鈉、NaCl、阿拉伯膠、納氏試劑、銨態(tài)氮標準溶液、雙蒸水四、 實驗步驟1、 準確稱取10.00g過1mm篩的風干土樣，置于150mL錐形瓶中，注入50mL20%的NaCl溶液，將瓶塞緊，在振蕩30min(120r/min)后，用定性濾紙過濾。2、 取20mL濾液于50mL容量瓶中，加雙蒸水稀釋至40mL左右，加2mL25%酒石酸鈉，充分搖動靜置5min，使其與Cd，Mg離子絡合；3、 再加入10滴1%阿拉伯膠，搖動后加2mL納氏試劑，邊加邊搖，定容至刻度，5min后用490nm比色，配制銨態(tài)氮標準溶液，繪制標準曲線，比色后求算土壤脲酶活性。4、 結果分析滴定法測定過氧化氫酶活性一、 試驗原理土壤的過氧化物酶活性，與土壤的呼吸強度和土壤微生物活動相關，在一定程度上反映土壤微生物過程的強度。根際土壤的過氧化物酶活性，遠較根際外土壤為高。有機質(zhì)含量高的土壤，過氧化氫酶活性較強。因此，土壤過氧化物酶的活性可以表征土壤總的生物學活性和肥力狀況。本試驗采用滴定法測定過氧化氫酶活性，即通過定量滴定酶促反應后剩余的過氧化氫量。二、 實驗儀器致密濾紙、酸式滴定管、1mm篩三、 實驗藥品雙蒸餾水、H2SO4、過氧化氫、KMnO4、四、 實驗步驟準確稱取5.00g過1mm篩的風干土樣，置于150mL錐形瓶中，注入40mL雙蒸餾水和5mL0.3%過氧化氫，另設對照，塞緊瓶蓋，振蕩30min(120r/min)后，注入5mL1.5mol/LH2SO4終止反應，用致密濾紙過濾，取濾液25mL，用0.1mol/LKMnO4滴定至微紅色。土壤的過氧化氫酶活性，用100g土重的0.1mol/LKMnO4毫升數(shù)表示。土壤微生物檢測一、取樣工具無菌刮鏟、土樣采集器、鑷子、手套、無菌小塑料袋和塑料瓶等。二、采土方式：在選好適當?shù)攸c后，用小鏟子除去表土，取離地面5-15cm處的土約10g，盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，標記，記錄采樣時間、地點、環(huán)境條件等，以備查考。為了使土樣中微生物的數(shù)量和類型盡少變化，宜將樣品立即進行處理或放在4冰箱中暫存。三、所需培養(yǎng)基及配置方法1、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（培養(yǎng)細菌用） 牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，瓊脂1520g，水1000ml，pH7.07.2，121滅菌20min。2、高氏（Gause）1號培養(yǎng)基（培養(yǎng)放線菌用） 可溶性淀粉20g，KNO3 1g，NaCl 0.5g，K2HPO4 0.5g，MgSO4.7H2O 0.5g，F(xiàn)eSO40.01g，瓊脂20g，水1000ml，pH7.27.4。配制時，先用少量冷水，將淀粉調(diào)成糊狀，倒入煮沸的水中，在火上加熱，邊攪拌邊加入其它成分，溶化后，補足水分至1000ml。121滅菌20min。3、無氮培養(yǎng)基（自身固氮菌、鉀細菌） 甘露醇（或葡萄糖）10g，KH2PO4 0.2g，MgSO47H2O 0.2g，NaCl 0.2g，CaSO42H2O 0.2g，CaCO3 5g，蒸餾水1000ml，pH7.07.2，113滅菌30min。4、馬丁氏（Martin）瓊脂培養(yǎng)基（分離真菌用） 葡萄糖10g，蛋白胨5g，KH2PO4 1g，MgSO47H2O 0.5g，1/3000孟加拉紅（rosebengal，玫瑰紅水溶液）100ml，瓊脂1520g，pH自然，蒸餾水800ml，121度滅菌30min。臨用前加入0.03%鏈霉稀釋液10ml，使每毫升培養(yǎng)基中含鏈霉素30g。5、 蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基 蛋白胨5克、KH2PO40.5g，NaCl 0.25g，瓊脂18克，MgSO47H2O 0.5g，F(xiàn)eSO4 0.01克，水1000毫升，pH7.2，一氣壓滅菌20分鐘滅菌。四、所需藥品牛肉膏、蛋白胨、NaCl、瓊脂、可溶性淀粉、KNO3、K2HPO4、MgSO4、FeSO4、甘露醇（或葡萄糖）、CaSO42H2O、CaCO3、孟加拉紅、鏈霉素五、檢測方法土壤中放線菌的檢測一、 試驗原理應用稀釋平板法從土壤中檢測放線菌二、 實驗儀器及試劑7個土樣，3個重復，共需252個滅菌培養(yǎng)皿；滅菌試管、滅菌吸管、滅菌三角燒瓶高氏一號培養(yǎng)基可溶性淀粉20g，KNO3 1g，NaCl 0.5g，K2HPO4 0.5g，MgSO40.5g，F(xiàn)eSO40.01g，瓊脂20g，水1000ml，pH7.27.4。配制時，先用少量冷水，將淀粉調(diào)成糊狀，倒入煮沸的水中，在火上加熱，邊攪拌邊加入其它成分，溶化后，補足水分至1000ml。121滅菌20min。三、 實驗步驟1、 在超凈工作臺中，無菌稱取所取土樣10g，分別溶于裝90ml無菌水及玻璃珠三角瓶中，于搖床震蕩30分鐘。用移液管分別無菌吸取各樣品土壤懸液1ml移入裝9ml無菌水試管中，此即為10-2稀釋的土壤懸液。如此操作，一直到10-10。稀釋。(另外，要知道所稱土樣的含水量)2、 倒人45恒溫水浴的滅菌高氏l號培養(yǎng)基，水平放置，凝固待用；分別無菌吸取各樣品10-4、10-5、10-6、10-7稀釋液，加入滅菌平皿中(每稀釋度3皿，每皿lml)，用玻璃涂布棒涂抹均勻，將平皿倒置于28恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。放線菌的培養(yǎng)時間較長，故制平板的培養(yǎng)基用量可適當增多3、 培養(yǎng)48h后，取出培養(yǎng)平皿，選出土樣適合菌落計數(shù)的稀釋度，算出同一稀釋度3個平皿上的菌落平均數(shù)（選擇平均菌落數(shù)在30-300之間的），并按下列公式進行計算，最后換算成每克干土壤中菌落形成單位。 每克土壤中菌落形成單位同一稀釋度3次重復的平均菌落數(shù)稀釋倍數(shù)。土壤中細菌的檢測一、 試驗原理應用稀釋平板法從土壤中分離細菌二、 實驗儀器及試劑7個土樣，3個重復，共需252個滅菌培養(yǎng)皿；滅菌試管、滅菌吸管、滅菌三角燒瓶牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，瓊脂1520g，水1000ml，pH7.07.2，121滅菌20min。三、 實驗步驟1、 在超凈工作臺中，無菌稱取所取土樣10 g，分別溶于裝90ml無菌水及玻璃珠三角瓶中，于搖床震蕩30分鐘。用移液管分別無菌吸取各樣品土壤懸液1ml移入裝9ml無菌水試管中，此即為10-2稀釋的土壤懸液。如此操作，一直到10-10。稀釋。(另外，要知道所稱土樣的含水量)2、分別無菌吸取各樣品10-5、10-6、10-7、10-8稀釋液，加入滅菌平皿中(每稀釋度3皿，每皿lml)，倒人45恒溫水浴的滅菌牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，混勻。（稀釋倍數(shù)是情況而定）3、待培養(yǎng)基凝固后，將平皿倒置于37恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4、培養(yǎng)24h后，取出培養(yǎng)平皿，選出土樣適合菌落計數(shù)的稀釋度，算出同一稀釋度3個平皿上的菌落平均數(shù)（選擇平均菌落數(shù)在30-300之間的），并按下列公式進行計算，最后換算成每克干土壤中菌落形成單位。 每克土壤中菌落形成單位同一稀釋度3次重復的平均菌落數(shù)稀釋倍數(shù)。土壤中真菌的檢測一、試驗原理應用稀釋平板法從土壤中檢測真菌二、實驗儀器及試劑7個土樣，3個重復，共需252個滅菌培養(yǎng)皿；滅菌試管、滅菌吸管、滅菌三角燒瓶、滅菌水馬丁氏（Martin）瓊脂培養(yǎng)基（分離真菌用） 葡萄糖10g，蛋白胨5g，KH2PO4 1g，MgSO47H2O 0.5g，1/3000孟加拉紅（rose bengal，玫瑰紅水溶液）100ml，瓊脂1520g，pH自然，蒸餾水800ml，121度滅菌30min。臨用前加入0.03%鏈霉稀釋液10ml，使每毫升培養(yǎng)基中含鏈霉素30g。（鏈霉素在培養(yǎng)基融化并冷卻至50攝氏度時加入，用剩的鏈霉素在冰箱可保存4個月，但每過一月，在1升培養(yǎng)基中需多加0.1ml）。三、實驗步驟1、在超凈工作臺中，無菌稱取所取土樣10g，分別溶于裝90ml無菌水及玻璃珠三角瓶中，于搖床震蕩30分鐘。用移液管分別無菌吸取各樣品土壤懸液1ml移入裝9ml無菌水試管中，此即為10-2稀釋的土壤懸液。如此操作，一直到10-10。稀釋。(另外，要知道所稱土樣的含水量)2、分別無菌吸取各樣品10-2、10-3、10-4、10-5稀釋液，加入滅菌平皿中(每稀釋度3皿，每皿lml)，倒人45恒溫水浴的滅菌馬丁氏（Martin）瓊脂培養(yǎng)基，混勻。（稀釋倍數(shù)是情況而定）3、待培養(yǎng)基凝固后，將平皿倒置于28恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4、培養(yǎng)48h后，取出培養(yǎng)平皿，選出土樣適合菌落計數(shù)的稀釋度，算出同一稀釋度3個平皿上的菌落平均數(shù)（選擇平均菌落數(shù)在30-300之間的），并按下列公式進行計算，最后換算成每克干土壤中菌落形成單位。 每克土壤中菌落形成單位同一稀釋度3次重復的平均菌落數(shù)稀釋倍數(shù)。土壤中自身固氮菌的檢測一、試驗原理應用稀釋平板法從土壤中檢測自身固氮菌。二、實驗儀器及試劑7個土樣，3個重復，共需252個滅菌培養(yǎng)皿；滅菌試管、滅菌吸管、滅菌三角燒瓶、滅菌水無氮培養(yǎng)基甘露醇（或葡萄糖）10g，KH2PO4 0.2g，MgSO47H2O 0.2g，NaCl 0.2g，CaSO42H2O 5g，CaCO3 1000ml，蒸餾水1000ml，pH7.07.2，113滅菌30min。三、實驗步驟1、在超凈工作臺中，無菌稱取所取土樣10 g，分別溶于裝90ml無菌水及玻璃珠三角瓶中，于搖床震蕩30分鐘。用移液管分別無菌吸取各樣品土壤懸液1ml移入裝9ml無菌水試管中，此即為10-2稀釋的土壤懸液。如此操作，一直到10-10。稀釋。(另外，要知道所稱土樣的含水量)2、分別無菌吸取各樣品10-5、10-6、10-7、10-8稀釋液，加入滅菌平皿中(每稀釋度3皿，每皿lml)，倒人45恒溫水浴的滅菌無氮培養(yǎng)基，混勻。（稀釋倍數(shù)視情況而定）3、待培養(yǎng)基凝固后，將平皿倒置于28恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4、培養(yǎng)48h后，取出培養(yǎng)平皿，選出土樣適合菌落計數(shù)的稀釋度，算出同一稀釋度3個平皿上的菌落平均數(shù)（選擇平均菌落數(shù)在30-300之間的），并按下列公式進行計算，最后換算成每克干土壤中菌落形成單位。 每克土壤中菌落形成單位同一稀釋度3次重復的平均菌落數(shù)稀釋倍數(shù)。土壤中氨化細菌的檢測一、試驗原理應用稀釋平板法從土壤中檢測自身固氮菌。二、實驗儀器及試劑7個土樣，3個重復，共需252個滅菌培養(yǎng)皿；滅菌試管、滅菌吸管、滅菌三角燒瓶、滅菌水蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基 蛋白胨5克、KH2PO40.5g，NaCl 0.25g，瓊脂18克，MgSO47H2O 0.5g，F(xiàn)eSO4 0.01克，水1000毫升，pH7.2，一氣壓滅菌20分鐘滅菌。三、實驗步驟1、在超凈工作臺中，無菌稱取所取土樣10g，分別溶于裝90ml無菌水及玻璃珠三角瓶中，于搖床震蕩30分鐘。用移液管分別無菌吸取各樣品土壤懸液1ml移入裝9ml無菌水試管中，此即為10-2稀釋的土壤懸液。如此操作，一直到10-10。稀釋。(另外，要知道所稱土樣的含水量)2、分別無菌吸取各樣品10-6、10-7、10-8、10-9稀釋液，加入滅菌平皿中(每稀釋度3皿，每皿lml)，倒人4