體外診斷產(chǎn)品簡介.ppt

體外診斷試劑產(chǎn)品簡介 醫(yī)學(xué)二部李子穎April2013 2 體外診斷試劑的概念 主要內(nèi)容 體外診斷試劑的分類介紹 化學(xué)發(fā)光產(chǎn)品行業(yè)情況 Q A 1 2 3 4 3 第一部分體外診斷試劑的概念 4 體外診斷試劑的概念 特點 用途 體外診斷試劑 是指采用免疫學(xué) 微生物學(xué) 分子生物學(xué)等原理或方法制備的 在體外通過檢測取自機體的某一部分 如血清 體液等 用于對人類疾病的診斷 檢測及流行病學(xué)調(diào)查等的診斷試劑 特點 體外診斷技術(shù)具有 便捷 快速 準(zhǔn)確 無痛 等特點 是目前診斷 檢測疾病的主要診斷技術(shù) 應(yīng)用領(lǐng)域 體外診斷試劑目前主要應(yīng)用于各類醫(yī)療機構(gòu) 而未來家庭用診斷試劑將會得到蓬勃發(fā)展 5 體外診斷試劑的分類 臨床生化試劑 免疫診斷試劑 分子診斷試劑 用途 檢測方式 優(yōu)點 缺點 測定 酶類 糖類 脂類 蛋白和非蛋白氮類 無機元素類 肝功能 臨床化學(xué)控制血清等幾大類產(chǎn)品 主要通過測定 酶類 蛋白類 元素 對 病毒類疾病 傳染性疾病 內(nèi)分泌 腫瘤 藥物檢測 血型鑒定 等進行診斷 主要通過 核酸和基因芯片 等技術(shù) 從基因角度對肝炎 性病 肺感染性疾病 優(yōu)生優(yōu)育 遺傳病基因 腫瘤等遺傳病進行檢測 可用普通半自動和一般生化分析儀進行檢測 對檢測設(shè)備要求較低 一般情況下需要精度高的專業(yè)全自動檢測設(shè)備檢測 對檢測設(shè)備要求較高 最高的體外診斷技術(shù) 需要專業(yè)的基因類檢測設(shè)備 檢測技術(shù)難度大 技術(shù)成熟 檢測成本低 目前是非蛋白類元素檢測的理想試劑 如 糖 脂類 應(yīng)用廣泛 檢測精度高 技術(shù)成熟 檢測成本適中 是蛋白類元素檢測理想的試劑 檢測范圍廣 檢測類別多 檢測精度最高 可從基因?qū)用嬖\斷疾病 檢測范圍有限 如 病毒類 性病 艾滋等 精度低 無法檢測基因類遺傳疾病 存在檢測死角 如無法檢測非酶類 蛋白類元素引起的疾病 糖尿病等 無法檢測到基因類遺傳疾病 技術(shù)成熟度相對較低 檢測成本高 不適合規(guī)?；茝V 6 我國體外診斷試劑的產(chǎn)品結(jié)構(gòu) 7 第二部分分類產(chǎn)品介紹 原理 應(yīng)用 8 體外診斷試劑 介紹內(nèi)容 免疫診斷放射免疫分析酶聯(lián)免疫分析化學(xué)發(fā)光免疫分析膠體金免疫層析試紙蛋白質(zhì)芯片 臨床生化全自動生化分析 分子診斷核酸檢測 9 1臨床生化試劑 臨床生化試劑主要有測定酶類 糖類 脂類 蛋白和非蛋白氮類 無機元素類 肝功能 臨床化學(xué)控制血清等幾大類產(chǎn)品 主是用于配合手工 半自動和一般全自動生化分析儀等儀器檢測 作為醫(yī)療檢測的基本組成部分 憑借其花費低 速度快的優(yōu)勢 臨床生化試劑將保持較大份額 并在相當(dāng)長一段時間內(nèi)很難被取代 10 1臨床生化試劑 臨床生化試劑 病人樣本 診斷試劑 酶 融合 診斷儀器 診斷結(jié)果 采用比色法檢測生化指標(biāo) 對蛋白類檢測精度相對較低 11 1臨床生化試劑 全自動生化儀分析原理 分光光度測定法和電勢測定法分析類型 終點法 速率法 固定時間法和間接離子選擇電極法 ISE 分析方法 比色法 比濁法 乳膠凝集法 均項酶免疫分析法 間接離子選擇電極法 ISE 12 1臨床生化試劑 全自動生化儀的檢查項目肝功 谷丙轉(zhuǎn)氨酶 ALT GPT 谷草轉(zhuǎn)氨酶 AST GOT 堿性磷酸酶 ALP 總膽紅素 T BIL 直接膽紅素 D BIL 總蛋白 TP 白蛋白 ALB 腎功 尿素氮 BUN 肌酐 Cre 二氧化碳結(jié)合力 CO2 尿酸 UA 血脂 總膽固醇 CHO 甘油三脂 TG 高密度脂蛋白膽固醇 HDL C 低密度脂蛋白膽固醇 LDL C 血糖 葡萄糖 GLU 心肌酶 肌酸激酶 CK 肌酸激酶同工酶 CK MB 乳酸脫氫酶 LDH a 羥丁酸脫氫酶 a HBDH 谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶 r GT 離子 鈣 Ca 磷 P 鎂 Mg 鉀 K 鈉 Na 氯 CL 等mg g 10 3 10 6g 13 2免疫診斷試劑 免疫診斷試劑是利用抗原與抗體互相結(jié)合的特異性反應(yīng)來進行定性或定量的診斷 無論是技術(shù)還是市場 此類試劑在目前所有診斷試劑產(chǎn)品中的發(fā)展都是最快的 免疫診斷試劑在診斷試劑盒中品種最多 根據(jù)診斷類別 可分為傳染性疾病 內(nèi)分泌 腫瘤 藥物檢測 血型鑒定等 14 免疫診斷 放射免疫分析 1959年由Yalow和Berson首先用于糖尿病患者血漿胰島素含量的測定 從而開創(chuàng)了放射免疫分析 基本原理 1 競爭結(jié)合分析 Ag Ab AgAb Ag Ab AgAb 2 IRMA 免疫放射分析 常用標(biāo)記核素 1 125I 射線 半衰期60天 2 3H 射線 半衰期12 3年測量儀器 1 計數(shù)儀 2 液閃儀 R Yalow 15 2免疫診斷試劑 免疫類診斷試劑 診斷技術(shù) 酶聯(lián)免疫技術(shù) 化學(xué)發(fā)光 膠體金 1 原理 將醫(yī)用酶同樣本反映 根據(jù)反應(yīng)物顏色的變化程度分析各類指標(biāo) 確定診斷結(jié)果2 優(yōu)點 技術(shù)成熟 成本最低3 缺點 操作復(fù)雜 耗時長 反應(yīng)試劑殘留存在放射性污染4 發(fā)展方向 目前是國內(nèi)主流技術(shù) 但未來逐步被化學(xué)發(fā)光替代 1 原理 將抗原抗體同樣本結(jié)合 然后由磁珠捕捉形成的反應(yīng)物 再加入發(fā)光促進劑 加速反應(yīng)物自發(fā)光速度和強度 用發(fā)光信號測量儀測量光子數(shù)量 據(jù)此診斷2 優(yōu)點 精確度高 無污染 檢測速度快 技術(shù)日益成熟3 缺點 成本相對高 技術(shù)成熟度在國內(nèi)相對弱4 發(fā)展方向 代表了免疫診斷的發(fā)展方向 1 原理 膠體性質(zhì)膠體金顆粒大小多在1 100nm 微小金顆粒穩(wěn)定地 均勻地 呈單一分散狀態(tài)懸浮在液體中 成為膠體金溶液 膠體金因而具有膠體的多種特性 特別是對電解質(zhì)的敏感性 2 優(yōu)點 快速 便捷3 缺點 成本高 靈敏度低 精確度低4 發(fā)展方向 急診領(lǐng)域 病人樣本 融合 診斷結(jié)果 16 2 1酶免疫分析 1966年 Nakane和Avrameas等分別報道用酶代替熒光素標(biāo)記抗體 建立了酶標(biāo)抗體技術(shù) enzyme labelledantibodytechnique 用于生物組織中抗原的定位和鑒定 1971年 Engvall VanWeemen等報道了酶聯(lián)免疫吸附試驗 從而建立了酶標(biāo)抗體的定量檢測技術(shù) 目前 免疫酶標(biāo)記技術(shù)已成為免疫診斷 檢測和分子生物學(xué)研究中應(yīng)用最廣泛的免疫學(xué)方法之一 17 2 1酶免疫分析 1 均相酶免疫測定法 EIA 主要用于測小分子抗原 酶標(biāo)抗原與待測抗原競爭結(jié)合定量抗體2 酶聯(lián)免疫吸附試驗 ELISA 為固相 非均相酶免疫測定法 目前應(yīng)用最廣泛的定性標(biāo)記免疫分析技術(shù) 也可用于定量分析 1971年vanWeeman 荷 等發(fā)明3 生物素 親和素系統(tǒng)免疫檢測法生物素標(biāo)記一抗或二抗 酶標(biāo)記親和素 18 2 1酶聯(lián)免疫吸附分析 ELISA ELISA中有三個必要的試劑 免疫吸附劑 結(jié)合物和酶的底物 1 已包被抗原或抗體的固相載體 免疫吸附劑 2 酶標(biāo)記的抗原或抗體 結(jié)合物 3 酶的底物 4 陰性對照品和陽性對照品 參考標(biāo)準(zhǔn)品 5 結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液 6 洗滌液 7 酶反應(yīng)終止液 19 2 1酶聯(lián)免疫吸附分析 ELISA 包被載體 96孔板 在ELISA中常用的標(biāo)記物為辣根過氧化物酶 HRP 堿性磷酸酶 AP 底物HRP 鄰苯二胺 OPD 四甲基聯(lián)苯胺 TMB 和ABTS 常用的TMB經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍色 終止反應(yīng)后呈黃色 吸收峰在450nmAP 底物為磷酸酯酶 一般采用對硝基苯磷酸酯作為底物 產(chǎn)物為黃色的對硝基酚 在405nm波長處有吸收峰 20 2 1酶聯(lián)免疫分析 儀器 21 2 1酶聯(lián)免疫吸附分析 ELISA 雙抗夾心 1 將抗體包被在固相載體上 2 如樣品中含有抗原 則結(jié)合為抗原抗體復(fù)合物 3 再加入酶標(biāo)記抗體 則結(jié)合為抗體 抗原 酶標(biāo)記抗體復(fù)合物 4 酶催化底物并顯色 22 2 1酶聯(lián)免疫吸附分析 酶標(biāo)抗原競爭法 1 將抗體包被在固相載體上 2 如樣品中含有抗原 則優(yōu)先競爭結(jié)合抗體 結(jié)合為抗原抗體復(fù)合物 3 同時加入酶標(biāo)記抗原 抗原沒有結(jié)合的位點酶標(biāo)記抗原去占據(jù) 則結(jié)合為酶標(biāo)記抗原 抗體復(fù)合物 4 酶催化底物并顯色 抗原 23 2 2化學(xué)發(fā)光免疫分析 化學(xué)發(fā)光免疫分析 ChemiluminescenceImmunoassay CLIA 是近十年來在世界范圍內(nèi)發(fā)展非常迅速的非放射性免疫分析 它具有高靈敏度 檢測范圍寬 操作簡便快速 標(biāo)記物穩(wěn)定性好 無污染 儀器簡單經(jīng)濟等優(yōu)點 它是放射性免疫分析與普通酶免疫分析的取代者 是免疫分析重要的發(fā)展方向 CLIA發(fā)展迅猛 已占各種免疫分析的首位 24 2 2化學(xué)發(fā)光免疫分析 化學(xué)發(fā)光是一種特異的化學(xué)反應(yīng) 有機分子吸收化學(xué)能后發(fā)生能級躍遷 產(chǎn)生一種高能級的電子激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定的中間體 當(dāng)其返回到基態(tài)而發(fā)出光子 即為化學(xué)發(fā)光 將化學(xué)發(fā)光與抗原抗體相結(jié)合而形成的免疫分析技術(shù) 即為化學(xué)發(fā)光免疫分析 化學(xué)發(fā)光的發(fā)光類型通常分為閃光型 flashtype 和輝光型 glowtype 兩種 閃光型發(fā)光時間很短 只有零點幾秒到幾秒 輝光型又稱持續(xù)型 發(fā)光時間從幾分鐘到幾十分鐘 或幾小時至更久 閃光型的樣品必須立即測量 必須配以全自動化的加樣及測量儀 測量輝光型的樣品可以使用通用型儀器 也可以配全自動化儀器 25 2 2化學(xué)發(fā)光免疫分析 化學(xué)發(fā)光免疫分析的類型1 直接化學(xué)發(fā)光免疫分析1 吖啶酯2 化學(xué)發(fā)光酶免疫分析1 魯米諾及其衍生物2 AMPPD3 電化學(xué)發(fā)光免疫分析1 三聯(lián)吡啶釕 26 2 2直接化學(xué)發(fā)光機理 夾心法 發(fā)光 Y Y Y 磁微粒 被測抗原 抗體 帶丫啶酯標(biāo)記物抗體 沖洗后 1 加入H2O2 pH 10 2 加入堿 pH 10 27 2 2HRP標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖 28 2 2電化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖 2020 1 30 29 可編輯 30 2 2化學(xué)發(fā)光免疫分析 儀器 31 2 3膠體金免疫層析試紙條 32 2 3膠體金免疫層析試紙條 層析法技術(shù)優(yōu)勢 簡單 現(xiàn)場 快速 1 打開包裝取出試紙條 2 直接插入待測樣品中 33 2 3膠體金免疫層析試紙條 與常規(guī)診斷相比 34 2 3膠體金免疫層析試紙條 試紙條的組成 測試線 T線 控制線 C線 膠體金墊 樣品墊 NC膜 硝酸纖維素膜 層析方向 PVC底板 有4個組分 吸水紙 樣品墊 玻璃纖維膜 膠體金墊 膜上吸附著干燥的金標(biāo)抗體 流動帶 硝酸纖維素膜 膜上包被著抗原或抗體條帶和能與標(biāo)記物直接起反應(yīng)的質(zhì)控物條帶 檢測帶 吸水紙 以上各組份首尾互相銜接 35 2 3膠體金免疫層析試紙條 檢測原理 基本原理是將已知的特異性抗原或抗體固定于硝酸纖維素膜上某一區(qū)帶作為檢測帶在樣品區(qū)滴加樣品后 借助毛細作用 樣品泳動至玻璃纖維膜 金標(biāo)復(fù)合物溶解 并與樣品進行抗原抗體反應(yīng) 形成復(fù)合物 繼續(xù)泳動至硝酸纖維素膜的檢測區(qū) 帶有金標(biāo)記的復(fù)合物被檢測區(qū)抗原或抗體捕獲 呈現(xiàn)紅色條帶 如樣品中沒有待測抗原或抗體 則不發(fā)生結(jié)合 即不顯色在硝酸纖維素膜檢測區(qū)附近一般再固定上針對金標(biāo)結(jié)合物相應(yīng)的抗原或抗體作為質(zhì)控帶 無論樣品中有無待測物 質(zhì)控線都應(yīng)顯示 如無 則檢測失敗 整個過程一般在15分鐘內(nèi)完成 操作簡單 快速 且不需任何儀器 36 2 3膠體金免疫層析法 舉例 以HCG檢測為例 HCG 亞基抗體Y2 羊抗鼠二抗固定于硝酸纖維素膜上 金標(biāo)HCG 亞基單抗Y1固定于玻璃纖維素膜上 37 2 4蛋白芯片 38 2 4蛋白芯片 蛋白質(zhì)芯片是指固定于支持介質(zhì)上的蛋白質(zhì)構(gòu)成的微陣列 39 2 4蛋白芯片 檢測原理 蛋白芯片技術(shù)的基本原理 將各種蛋白質(zhì)有序地固定于滴定板 濾膜和載玻片等各種載體上 然后 用標(biāo)記了特定熒光的蛋白質(zhì)或其他成分與芯片作用 經(jīng)漂將未能與芯片上的蛋白質(zhì)互補結(jié)合的成分洗去 再利用熒光掃描儀或激光共聚焦掃描技術(shù) 測定芯片上各點的熒光強度 通過熒光強度分析蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用的關(guān)系 由此達到測定各種蛋白質(zhì)功能的目的 固定在芯片上的蛋白可以是 抗原 抗體 小肽 受體和配體 蛋白質(zhì) DNA和蛋白質(zhì) RNA復(fù)合物等 40 2 4蛋白芯片 優(yōu)勢 蛋白芯片較之傳統(tǒng)分析方法主要有以下優(yōu)點1 蛋白芯片上可以實現(xiàn)成千上萬個蛋白質(zhì)樣品的高通量平行分析 一次實驗可提供大量數(shù)據(jù) 高通量2 有高的信噪比 高準(zhǔn)確性 高靈敏度3 所需樣品量極少 微量化4 在整個基因組和蛋白質(zhì)組水平將 序列信息與蛋白質(zhì)產(chǎn)物直接聯(lián)系起來5 快速 微型化和自動化 41 2 4蛋白芯片的檢測 探針標(biāo)記檢測法 無探針標(biāo)記檢測法 表面增強激光解吸離子化技術(shù) Surfaceenhancedlaserdesorption ionization SELDI 表面等離子體共振檢測技術(shù) surfaceplasmonresonance SPR 原子力顯微鏡檢測技術(shù) atomicforcemicroscope AFM 同位素標(biāo)記檢測熒光標(biāo)記檢測化學(xué)發(fā)光檢測酶免疫標(biāo)記檢測膠體金標(biāo)記檢測 42 2 4蛋白芯片的應(yīng)用和問題 疾病診斷和預(yù)警藥物開發(fā)蛋白質(zhì)組學(xué) 成本過高 需一系列昂貴的尖端儀器芯片的標(biāo)準(zhǔn)化問題提高芯片的特異性 簡化樣品制備和標(biāo)記操作程序 增加信號檢測的靈敏度和消除芯片背景對于結(jié)果分析的影響等等 43 3核酸檢測 核酸檢測 nucleicacidtesting NAT 是直接檢測病原體核酸的一系列技術(shù)的總稱 可在尚未檢測到抗原或抗體前 先檢測到病毒核酸 其基本步驟包括核酸提取 擴增和檢測 也就是常說的基因檢測 是通過血液 其他體液或細胞對DNA進行檢測的技術(shù) 可以診斷疾病 也可以用于疾病風(fēng)險的預(yù)測 44 3核酸檢測的特點 顯著縮短窗口期 HIV窗口期縮短45 HCV縮短89 HBV縮短50 提高靈敏度 理論上擴增體系中單拷貝模板也能被檢測出 特異性好 使用熒光探針技術(shù)的PCR檢測 幾乎沒有方法學(xué)的假陽性 直接揭示病原體的存在對