第七屆挑戰(zhàn)杯大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競賽作品申報書VIP

序號： 編碼： 第七屆“挑戰(zhàn)杯”廣東大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競賽作品申報書 作品名稱：中宇宙法研究土霉素殘留對底泥細(xì)菌耐藥性的影響 學(xué)校全稱： 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 申報者姓名 （集體名稱）： 陳曉梅 類別：自然科學(xué)類學(xué)術(shù)論文 哲學(xué)社會科學(xué)類社會調(diào)查報告和學(xué)術(shù)論文 科技發(fā)明制作A類 科技發(fā)明制作B類 第七屆“挑戰(zhàn)杯”廣東大學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品競賽組委會制二00二年九月說 明1申報者應(yīng)在認(rèn)真閱讀此說明各項內(nèi)容后按要求詳細(xì)填寫。2申報者在填寫申報作品情況時只需根據(jù)個人項目或集體項目填寫A1或A2表，根據(jù)作品類別（自然科學(xué)類學(xué)術(shù)論文、哲學(xué)社會科學(xué)類社會調(diào)查報告和學(xué)術(shù)論文、科技發(fā)明制作）分別填寫B(tài)1、B2或B3表。所有申報者可根據(jù)情況填寫C表。3表內(nèi)項目填寫時一律用鋼筆或打印，字跡要端正、清楚，此申報書可復(fù)制。4序號、編碼由各高校根據(jù)作品種類填寫。5學(xué)術(shù)論文、社會調(diào)查報告及所附的有關(guān)材料必須是中文（若是外文，請附中文本），請以4號楷體打印在A4紙上，附于申報書后，學(xué)術(shù)論文及有關(guān)材料在8000字以內(nèi)，社會調(diào)查報告在15000字以內(nèi)（文章版面尺寸14.522cm左右）。6各高校的作品（數(shù)量參照“作品數(shù)額分配方案”）各一式四份分別按規(guī)定的時間用特快專遞寄至省競賽組委會辦公室。7作品申報書須按要求由各校競賽組織協(xié)調(diào)機(jī)構(gòu)統(tǒng)一寄送。8其他參賽事宜請向本校競賽組織協(xié)調(diào)機(jī)構(gòu)咨詢。9寄送地址：廣州市東山區(qū)寺貝通津一號大院團(tuán)省委學(xué)校部“挑戰(zhàn)杯”競賽組委會。聯(lián) 系 人：唐 銳、黃廉東聯(lián)系電話：（020）87778918、87185614傳 真：（020）87778918、87185613郵政編碼：510080 A1申報者情況（個人項目）說明：1必須由申報者本人按要求填寫，申報者情況欄內(nèi)必須填寫 個人作品的第一作者（承擔(dān)申報作品60%以上的工作者）； 2本表中的學(xué)籍管理部門簽章視為對申報者情況的確認(rèn)。姓 名陳曉梅性別女出生年月1980年2月申報者情況學(xué)校全稱華南農(nóng)業(yè)大學(xué)現(xiàn)學(xué)歷本科生專 業(yè)獸醫(yī)年級99級學(xué)制五年入學(xué)時間99年9月作品全稱中宇宙法研究土霉素殘留對底泥細(xì)菌耐藥性的影響畢業(yè)論文題目通訊地址華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院99（2）班郵政編碼510642單位電話85280233常住地通訊地址華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)生宿舍五山區(qū)A-415郵政編碼510642住宅電話38676321合作者情況姓 名性別年齡學(xué)歷所在單位資 格 認(rèn) 定學(xué)校學(xué)籍管理部門意見 是否為2003年7月1日前正式注冊在校的全日制非成人教育、非在職的各類高等院校中國學(xué)生（含專科生、本科生和研究生）。是 否若是，其學(xué)號為：1999311205 （部門蓋章） 2002年 11月8日院系負(fù)責(zé)人或?qū)熞庖?本作品是否為課外學(xué)術(shù)科技或社會實踐活動成果 是 否 負(fù)責(zé)人簽名： 2002年11月9 日B1申報作品情況（自然科學(xué)類學(xué)術(shù)論文）說明：1必須由申報者本人填寫；2本部分中的科研管理部門簽章視為對申報者所填內(nèi)容的確認(rèn)；3作品分類請按作品的學(xué)術(shù)方向或所涉及的主要學(xué)科領(lǐng)域填寫；4碩士研究生、博士研究生作品不在此列。作品全稱中宇宙法研究土霉素殘留對底泥細(xì)菌耐藥性的影響作品分類（D）A機(jī)械與控制（包括機(jī)械、儀器儀表、自動化控 制、工程、交通、建筑等） B信息技術(shù)（包括計算機(jī)、電信、通訊、電子等） C數(shù)理（包括數(shù)學(xué)、物理、地球與空間科學(xué)等） D生命科學(xué)（包括生物、農(nóng)學(xué)、藥學(xué)、醫(yī)學(xué)、健 康、衛(wèi)生、食品等） E能源化工（包括能源、材料、石油、化學(xué)、化 工、生態(tài)、環(huán)保等）作品撰寫的目的和基本思路用中宇宙法，即人工模擬池塘生態(tài)系統(tǒng)來研究不同濃度鹽酸土霉素對池塘生態(tài)系統(tǒng)中底泥弧菌的耐藥特性的影響，同時了解耐藥菌對四環(huán)素類抗生素的交叉耐藥性。為尚處于初步起始階段的抗生素環(huán)境安全評價工作提供基本的數(shù)據(jù)。作品的科學(xué)性、先進(jìn)性及獨(dú)特之處人工建立池塘生態(tài)系統(tǒng)的中宇宙法有明顯的科學(xué)性和創(chuàng)新性；有代表性地選擇畜牧和水產(chǎn)上應(yīng)用較為廣泛的土霉素來研究抗生素殘留對環(huán)境微生物的耐藥性影響在國內(nèi)以至國際上具有一定的前瞻性和先進(jìn)性。作品的實際應(yīng)用價值和現(xiàn)實意義該作品用中宇宙法研究土霉素對底泥細(xì)菌的耐藥性影響，很好的模擬池塘生態(tài)環(huán)境，克服了田間試驗所存在干擾因素多的缺點，研究的內(nèi)容涉及抗生素殘留對環(huán)境微生物耐藥性的影響，提供可作為今后抗生素殘留環(huán)境安全評價工作的基本數(shù)據(jù)。學(xué)術(shù)論文文摘人工模擬多個池塘生態(tài)環(huán)境，即中宇宙來研究不同濃度的鹽酸土霉素對池塘生態(tài)系統(tǒng)中底泥弧菌的耐藥特性的影響，同時了解耐藥菌對四環(huán)素類抗生素的交叉耐藥性。從而為尚處于起始階段的抗生素環(huán)境安全評價工作提供基本的數(shù)據(jù)。在實驗過程中，施藥前中宇宙E中能分離到大量的特征弧菌，而在用藥后則分離不到特征弧菌；這可能是因為高劑量的藥物殺滅了該特征細(xì)菌。中宇宙B、C、D中的特征弧菌均明顯地對土霉素產(chǎn)生耐藥性。但是從各宇宙在用藥前后的耐藥率比較看，耐藥率并沒有同藥物濃度之間呈現(xiàn)出良好的相關(guān)性，這一現(xiàn)象同ORelly(2001)等的報道是一致的，其原因可以解釋為藥物在底泥環(huán)境中能夠與金屬離子結(jié)合而抑制其活性，使耐藥率與用藥濃度之間無法形成有效的規(guī)律性。本試驗中在用藥后第70d分離所得的弧菌對土霉素的耐藥率呈明顯的上升趨勢且耐藥水平也有升高的趨勢。該現(xiàn)象可以解釋為：底泥中藥物不易發(fā)生降解和轉(zhuǎn)移，長期的藥物存在可以對弧菌誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥性并誘導(dǎo)出高水平耐藥株。交叉耐藥性試驗表明：誘導(dǎo)出的耐藥株對四環(huán)素類藥物具有明顯的交叉耐藥現(xiàn)象。其中對四環(huán)素是完全交叉耐藥，而對強(qiáng)力霉素和米洛霉素為高水平交叉耐藥。存在以上區(qū)別可能是這些藥物不同的耐藥機(jī)制所致。 作品在何時、何地、何種機(jī)構(gòu)舉行的會議上或報刊上發(fā)表及所獲獎勵無鑒定結(jié)果請?zhí)峁τ诶斫狻彶?、評價所申報作品具有參考價值的現(xiàn)有技術(shù)及技術(shù)文獻(xiàn)的檢索目錄1.陳杖榴，楊桂香，孫永學(xué)等. 獸藥殘留的毒性與生態(tài)毒理研究進(jìn)展. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2001，22（1）：8891.2.Halling-Serensen, S.Nors Nielsen, P.F.Lanzky et al. Occurrence, fate and effects of pharmaceutical substances on the environment-a review. Chemosphere,1998,36:357393. 3.Michael Teuber. Veterinary use and antibiotic resistance. Current Opinion in Microbiology,2001,4:493499.4.Nygaard, B.T.Lunestad, H.Hektoen et al. Resistance to oxytetracycline, oxolinic acid and furazolidone in bacteria from marine sediments. Aquaculture,1992,104:3136.5.Erve.P, Herve.L.B, Louis.P. Experimental study on the decontamination kinetics of seawater polluted by oxytetracycline contained in effluents released from a fish farm located in a salt-marsh. Aquaculture,1993,112:113123.6.R.Hirsh, T.Ternes, K.Haberer et al. Occurrence of antibiotics on the aquatic environment. The Science of the Total Environment,1999,225:109118.7.Sara.G, Bengt-Erik.B. Chemicals and biological products used in south-east Asian shrimp farming, and their potential impact on the environment a review. The Science of the Total Environment,2001,280:93131.8.Michael J.B, Dean C.L. The use of temporary pond microcosms for aquatic toxicity testing: direct and indirect effects of endosulfan on community structure. Aquatic Toxicology,1998,41:1011249.S.Vaughan, P.Smith. Estimation of the influence of a river sediment on the biological activity of oxytetracycline hydrochloride. Aquaculture,1996,141:6776.10.B.Samuelsen, V.Torsivik, A.Ervik. Long-range changes in oxytetracycline concentration and bacterial resistance towards oxytetracycline in a fish farm sediment after medication. The Science of the Total Environment,1992,114:253611.A.OReilly, P.Smith. Use of indirect conductimetry to establish predictive no effect concentrations of oxytetracycline and oxolinic acid in aquatic sediments. Aquaculture,2001,196:1326.申報材料清單（申報論文一篇，相關(guān)資料名稱及數(shù)量）申報論文一篇科研管理部門簽章以上情況屬實 2002年11 月8日C.當(dāng)前國內(nèi)外同類課題研究水平概述 說明：1.申報者可根據(jù)作品類別和情況填寫； 2.填寫此欄有助于評審。目前，國外關(guān)于抗生素殘留對環(huán)境微生物的耐藥性影響的研究尚處于較為初步的狀態(tài)。但隨著研究的深入，已經(jīng)越來越引起人們的關(guān)注。目前的研究主要是進(jìn)行田間試驗。但田間試驗由于影響因素較多，使各學(xué)者的研究成果之間存在較大的差異。因此已經(jīng)有少部分學(xué)者轉(zhuǎn)向了用微宇宙法或中宇宙法進(jìn)行研究，以獲得更為確切的、可比性更強(qiáng)的實驗數(shù)據(jù)，為抗生素殘留的環(huán)境安全性評價提供重要依據(jù)。國內(nèi)這方面的研究較為空白，尚未見有公開發(fā)表的研究文獻(xiàn)。D.推薦者情況及對作品的說明說明：1由推薦者本人填寫； 2推薦者必須具有高級專業(yè)技術(shù)職稱，并是與申報作品相同或相關(guān)領(lǐng)域的專家學(xué)者或?qū)I(yè)技術(shù)人員（教研組集體推薦亦可）； 3推薦者填寫此部分，即視為同意推薦； 4推薦者所在單位簽章僅被視為對推薦者身份的確認(rèn)。推薦者情況姓 名楊桂香性別女年齡37 職稱副教授工作單位華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院藥理研究室通訊地址華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院藥理研究室郵政編碼510642單位電宅電話85282730推薦者所在單位簽章楊桂香是我院副教授 （簽章） 2002年11月9日請對申報者申報情況的真實性作出闡述該申報作品是陳曉梅同學(xué)在本人和藥理學(xué)博士生俞道進(jìn)的指導(dǎo)下，利用課余時間和暑期在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院藥理研究室和室外建立的池塘生態(tài)環(huán)境進(jìn)行艱苦的持之以恒的摸索和試驗的研究成果。 請對作品的意義、技術(shù)水平、適用范圍及推廣前景作出您的評價對抗生素殘留對環(huán)境微生物耐藥性的研究在國際上尚處于初步階段。該作品在國內(nèi)這方面的研究還是空白的背景下產(chǎn)生，具有前瞻性，為仍處于起始階段的抗生素環(huán)境安全評價提供了基本的數(shù)據(jù)。特別是在室外建立中宇宙的方法表現(xiàn)了技術(shù)的創(chuàng)新性。其它說明推薦者情況姓 名葉啟薇性別女年齡52職稱高級實驗師工作單位華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院藥理研究室通訊地址華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院郵編510642單位電話85280237住宅電話（020）85280839推薦者所在單位簽章葉啟薇是我院高級實驗師 簽章日期 2002年11月9日 請對申報者申報情況的真實性作出闡述在楊桂香副教授和博士生俞道進(jìn)的指導(dǎo)下，陳曉梅同學(xué)利用暑期和課余時間持之以恒的在獸醫(yī)學(xué)院藥理研究室和室外試驗基地進(jìn)行了實驗，其吃苦耐勞和刻苦鉆研的精神得到了藥理教研室眾多老師的好評。 請對作品的意義、技術(shù)水平、適用范圍及推廣前景作出您的評價該作品有兩個突出特點：一、研究抗生素殘留對環(huán)境微生物耐藥性的影響，站到了一個生態(tài)保護(hù)的高度，為環(huán)境安全評價工作提供基本數(shù)據(jù)，目前這方面的研究在國內(nèi)比較少見；二、具有創(chuàng)新思維，運(yùn)用中宇宙法進(jìn)行研究克服了田間試驗的多種干擾因素。其它說明 學(xué)校組織協(xié)調(diào)機(jī)構(gòu)確認(rèn)并蓋章以上情況屬實 （團(tuán)委代章）2002年11月9日 校主管領(lǐng)導(dǎo)或校主管部門確認(rèn)蓋章同意上報。 2002年11月9 日 校評審委員會初評意見 評委簽名： 年 月 日 校組織協(xié)調(diào)委員會審定意見 （簽章） 年 月 日E全省組織委員會秘書處資格和形式審查意見組委會秘書處資格審查意見 審查人（簽名） 年 月 日組委會秘書處形式審查意見 審查人（簽名） 年 月 日組委會秘書處審查結(jié)果合格 不合格 負(fù)責(zé)人（簽名） 年 月 日F參賽作品打印處中宇宙法研究土霉素殘留對底泥細(xì)菌耐藥性的影響陳曉梅（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 廣州 510642）摘 要：人工模擬多個池塘生態(tài)環(huán)境，即中宇宙來研究不同濃度的鹽酸土霉素對池塘生態(tài)系統(tǒng)中底泥弧菌的耐藥特性的影響，同時了解耐藥菌對四環(huán)素類抗生素的交叉耐藥性。從而為尚處于起始階段的抗生素環(huán)境安全評價工作提供基本的數(shù)據(jù)。關(guān)鍵詞：中宇宙、鹽酸土霉素、底泥、耐藥性、交叉耐藥性前 言隨著集約化畜牧業(yè)的發(fā)展，抗生素的應(yīng)用也越來越多。這些抗生素能防治疾病和促進(jìn)動物生長，但是應(yīng)用于動物的抗生素能以原形或代謝物形式隨糞便排泄到環(huán)境中。由于抗生素的生物活性，進(jìn)入環(huán)境中的抗生素可作用于環(huán)境生態(tài)系統(tǒng)的各個層面，并最終將對人類的生存環(huán)境和健康造成不利影響13。目前普遍認(rèn)為在抗生素殘留對環(huán)境的諸多影響中，抗生素對環(huán)境細(xì)菌的耐藥性的選擇和誘導(dǎo)以及這種耐藥性在時空上的傳播是其最重要的一面，同時也是與人類公共衛(wèi)生關(guān)系最為密切的一面4。水環(huán)境作為畜牧和水產(chǎn)用藥的最終歸宿地，常常積累了大量的抗生素殘留，因此水環(huán)境可能作為環(huán)境耐藥細(xì)菌的重要儲庫而在研究上具有特殊重要的意義57。目前國際上普遍采用模擬生態(tài)系統(tǒng)的方法來研究外來化學(xué)物質(zhì)對環(huán)境的影響。其中，中宇宙是指體積大于1m3的模擬生態(tài)系統(tǒng)8，9。該方法可以很好地模擬田間環(huán)境同時可以排除田間試驗的各種干擾因素，使試驗結(jié)果具有更好的可比性。本試驗選擇在畜牧和水產(chǎn)生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用的土霉素來研究其對模擬池塘生態(tài)系統(tǒng)中的底泥弧菌的耐藥特性的影響，以期為今后的抗生素殘留環(huán)境安全性評價工作積累基本數(shù)據(jù)。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 藥物和試劑鹽酸土霉素，江西國藥股份有限公司，批號：0202060， 含量84.9%鹽酸四環(huán)素，四川制藥，批號：PX-2TCH 2246B, 988.8/mg強(qiáng)力霉素，上海五洲，批號：HS0130, 842/mg米洛霉素，蘇州立達(dá)，批號：TE27, 1000/mgTCBS瓊脂，批號200207104，廣東環(huán)凱微生物科技公司營養(yǎng)肉湯，批號20020403，杭州天和微生物試劑有限公司1.1.2 儀器水平搖床，HS 250 B型，馬來西亞IKA公司電子分析天平，AE160型，瑞士Mettler公司1.2 方法1.2.1 池塘中宇宙模擬生態(tài)系統(tǒng)的建立1.2.1.1 中宇宙的建立和調(diào)試建立6個高為1m，體積為5.3m3的水泥壁小池塘；等份加入未曾接觸過抗生素的養(yǎng)魚池底泥，同時加入等體積的水，自然光照，適當(dāng)添加水至系統(tǒng)成熟。1.2.1.2 測試指標(biāo)及系統(tǒng)成熟的標(biāo)志系統(tǒng)成熟前每周測定溶解氧、pH值、水溫等參數(shù),每周用黑白瓶法測定系統(tǒng)晝夜呼吸率以推算P/R值。不同系統(tǒng)各項指標(biāo)的變異系數(shù)小于20%30%即可認(rèn)為系統(tǒng)穩(wěn)定。1.2.1.3 實驗分組及用藥在系統(tǒng)中符合要求的5口池塘進(jìn)行試驗，分別設(shè)一個空白對照組和四個用藥組。鹽酸土霉素用藥濃度分別相當(dāng)于土霉素0.8g/ml、4.0g/ml、20.0g/ml、100g/ml。先將藥物溶解于潔凈桶中，全池潑灑并適當(dāng)混勻。各中宇宙藥物濃度如下：表1 各中宇宙藥物濃度中宇宙ABCDE用藥濃度0g/ml0.8g/ml4.0g/ml20.0g/ml100g /ml1.2.2 水體中底泥樣品的采集和弧菌的分離培養(yǎng)1.2.2.1 采樣器的制作根據(jù)Samuelsen（1992）的文獻(xiàn)10制作底泥采樣器。1.2.2.2 采樣的時間和方法在用藥前一天、用藥后第21d、用藥后第70d分別在各中宇宙中分10個點采集柱狀泥樣，緩慢地將泥柱推入潔凈的白瓷盤中。1.2.2.3 水體底泥樣品的處理取并列排放于白瓷盤的10個泥柱的前2cm于封口膠袋中混合均勻，分別取出15g于250ml的滅菌錐形瓶中，加入100ml的滅菌蒸餾水，于水平搖床上以275rpm振蕩10min后，靜置10min，再將上清液傾入另一250ml的滅菌錐形瓶。1.2.2.4 弧菌的分離培養(yǎng)方法將上述各中宇宙的上清液用滅菌蒸餾水稀釋101000倍。取0.2ml稀釋液緩慢加入事先制備好的TCBS瓊脂上，用無菌三角形玻璃推刀將稀釋液推至均勻。再將上述TCBS瓊脂倒置,在25培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h,觀察細(xì)菌生長情況。在TCBS培養(yǎng)基上長成的深綠色、半透明、外圈有白暈的中等大小的菌落為優(yōu)勢菌落。挑取優(yōu)勢菌落分別接種于5ml滅菌營養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)48h。1.2.3 土霉素對弧菌耐藥性的影響1.2.3.1 鹽酸土霉素藥液的配制準(zhǔn)確稱取適量鹽酸土霉素于100ml容量瓶中，加蒸餾水定容，充分混勻，配成濃度為1280g/ml的儲備液，4冰箱中保存。臨用前以0.22um的濾膜除菌。1.2.3.2 藥物敏感性試驗取10ml滅菌試管6支。將菌液用營養(yǎng)肉湯稀釋至約為105個細(xì)菌/ml，除第一管加入稀釋菌液1.8ml外，其余各管均加入1.5ml，然后向第一管加入1280g/ml鹽酸土霉素0.2ml，混勻后，吸出0.5ml加入到第二管。同樣方法依次稀釋到第5管，棄去0.5ml，第6管為藥物空白對照管。6支試管的藥物濃度分別為：128g/ml、32g/ml、8g/ml、2g/ml、0.5g/ml、0ug/ml。稀釋完畢后，蓋好試管，置25培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h后觀察結(jié)果。每株受試細(xì)菌分別做2次重復(fù)。1.2.3.3 結(jié)果判斷取出試管逐支搖勻后觀察。若培養(yǎng)液中含有絮狀物沉淀或不澄明的管判為有細(xì)菌生長；以澄清透亮的管判為無細(xì)菌生長。無細(xì)菌生長的最低藥物濃度為最低抑菌濃度(MIC)。如果6支試管全部有細(xì)菌生長，則說明池塘生態(tài)中的弧菌對土霉素的MIC128g/ml（第1管的藥物濃度）。1.2.4 耐藥菌交叉耐藥試驗1.2.4.1 各種藥液的配制按1.2.3.1的方法配制濃度為1280g/ml的四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、米洛霉素的儲備液。視情況進(jìn)行不同的稀釋。1.2.4.2 交叉耐藥性試驗選取以上藥物敏感試驗中的敏感弧菌和耐藥弧菌分別研究其對四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、米洛霉素的敏感性，以考查底泥耐藥弧菌對同類藥物的交叉耐藥程度。取10ml滅菌試管9支。將菌液用營養(yǎng)肉湯稀釋至約為105個細(xì)菌/ml。除第一管加入稀釋菌液1.8ml外，其余各管均加入1.5ml，然后向第一管分別加入1280g/ml藥液0.2ml，混勻后，吸出0.5ml加入到第二管。同樣方法依次稀釋到第8管，棄去0.5ml，第9管為藥物空白對照管。那么，這9支試管的藥物濃度分別為：128g/ml、32g/ml、8g/ml、2g/ml、0.5g/ml、0.125g/ml、0.031g/ml、0.008g/ml、0g/ml。稀釋完畢后，蓋好試管，置25培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h后觀察結(jié)果。每種藥物對于每株受試細(xì)菌分別做2次重復(fù)。1.2.4.3 結(jié)果判斷取出試管逐支搖勻后觀察。若搖蕩試管發(fā)現(xiàn)有絮狀物沉淀或不澄明的管判為有細(xì)菌生長；以澄清透亮的管判為無細(xì)菌生長。無細(xì)菌生長的最低濃度為最低抑菌濃度（MIC）。如果9支試管全部有細(xì)菌生長，則說明：池塘生態(tài)中弧菌對該抗生素的敏感度128g/ml（第1管的藥物濃度）。2 結(jié)果2.1 土霉素對中宇宙弧菌耐藥性的影響2.1.1 用藥前中宇宙A、B、C、D、E中的弧菌對土霉素耐藥情況見表2：表2 用藥前各中宇宙特征弧菌在不同水平MIC時菌株數(shù)中宇宙試驗菌株數(shù)各MIC值的菌株數(shù)128g/ml128g/ml32g/ml8g/ml2g/ml0.5g/mlA3543331210B363123261C381312301D373426211E58043530162.1.2 用藥后第21d中宇宙E分離不出特征弧菌，中宇宙A、B、C、D中弧菌對土霉素耐藥情況見表3：表3 用藥后21天各中宇宙特征弧菌在不同水平MIC時菌株數(shù)中宇宙試驗菌株數(shù)各MIC值的菌株數(shù)128g/ml128g/ml32g/ml8g/ml2g/ml0.5g/mlA230703121B25821671C293163115D26111102112.1.3 用藥后第70d中宇宙E分離不出特征弧菌，中宇宙A、B、C、D中弧菌對土霉素耐藥情況見表4：表4 用藥后70天各中宇宙特征弧菌在不同水平MIC時菌株數(shù)中宇宙試驗菌株數(shù)各MIC值的菌株數(shù)128g/ml128g/ml32g/ml8g/ml2g/ml0.5g/mlA390002334B4011270020C340188323D4034202202.1.4 以中宇宙D在用藥前的10株弧菌和用藥后第21d分離得到的14株弧菌來研究其對四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、米洛霉素的交叉耐藥性，其試驗結(jié)果見表5：表五 四環(huán)素類藥物交叉耐藥試驗結(jié)果藥物名稱時間各MIC值的菌株數(shù)12812832820.50.1250.0310.008四環(huán)素用藥前000002800用藥后176000000強(qiáng)力霉素用藥前000000910用藥后0002111000米洛霉素用藥前0000001000用藥后002273000注：1280.008的單位為g/ml。2.2 對藥物敏感性試驗結(jié)果的分析2.2.1 以MIC=2g/ml為基準(zhǔn)，則敏感度大于16g/ml的菌株為耐藥菌株。以這個標(biāo)準(zhǔn)來分析用藥前后弧菌對土霉素敏感程度，反映了土霉素明顯誘導(dǎo)中宇宙中弧菌的耐藥性。表6 細(xì)菌耐藥率變化表中宇宙用藥前用藥后第21天用藥后第70天試驗株耐藥株耐藥率試驗株耐藥株耐藥率試驗株耐藥株耐藥率A351028.57%23730.43%3900%B36616.67%251144.0%403895.0%C38513.16%291034.48%302686.67%D371129.73%262284.62%403690.0%E58712.07%注：用藥后在E中宇宙中分離不到優(yōu)勢弧菌。用t檢驗比較用藥前和用藥后21天的耐藥菌株數(shù)，發(fā)現(xiàn)空白對照組（A）在用藥前后的耐藥率差異不顯著（P0.05）；而用藥組除E組分離不出優(yōu)勢細(xì)菌外，用藥前后的耐藥率均差異極顯著（P0.01）。2.2.2 以MIC=0.125g/ml為基準(zhǔn)，則敏感度大于1.000g/ml的菌株為耐藥菌株。用這個標(biāo)準(zhǔn)來比較和分析池塘生態(tài)中弧菌在用藥前后對不同的四環(huán)素類藥物的敏感程度，可以明顯觀察到交叉耐藥現(xiàn)象。表7 細(xì)菌交叉耐藥試驗結(jié)果藥物名稱用藥前用藥后第21天試驗株耐藥株耐藥率試驗株耐藥株耐藥率四環(huán)素1000%1414100%強(qiáng)力霉素1000%141392.86%米洛霉素1000%141178.57%3 討論在實驗過程中，施藥前中宇宙E中能分離到大量的特征弧菌，而在用藥后則分離不到特征弧菌；這可能是因為高劑量的藥物殺滅了該特征細(xì)菌。中宇宙B、C、D中的特征弧菌均明顯地對土霉素產(chǎn)生耐藥性。但是從各宇宙在用藥前后的耐藥率比較看，耐藥率并沒有同藥物濃度之間呈現(xiàn)出良好的相關(guān)性，這一現(xiàn)象與ORelly（2001）等11的報道是一致的，其原因可以解釋為藥物在底泥環(huán)境中能夠與金屬離子結(jié)合而抑制其活性，使耐藥率與用藥濃度之間無法形成有效的規(guī)律性。本試驗中在用藥后第70d分離所得的弧菌對土霉素的耐藥率呈明顯的上升趨勢且耐藥水平也有升高的趨勢。該現(xiàn)象可以解釋為：底泥中藥物不易發(fā)生降解和轉(zhuǎn)移，長期的藥物存在可以對弧菌誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥性并誘導(dǎo)出高水平耐藥株。交叉耐藥性試驗表明：誘導(dǎo)出的耐藥株對四環(huán)素類藥物具有明顯的交叉耐藥現(xiàn)象。其中對四環(huán)素是完全交叉耐藥，而對強(qiáng)力霉素和米洛霉素為高水平交叉耐藥。存在以上區(qū)別可能是這些藥物不同的耐藥機(jī)制所致。本實驗結(jié)果表明：單劑量給予不同濃度的土霉素都能對池塘生態(tài)系統(tǒng)中特征性耐藥弧菌具有明顯的選擇作用，且由于藥物長期存在于底泥環(huán)境，不容易發(fā)生降解和轉(zhuǎn)移，使底泥中可以長期維持高水平的耐藥菌的存在。對于多劑量給藥本實驗并沒有進(jìn)行研究，但多劑量給藥所造成的環(huán)境危害性必然更加嚴(yán)重。有研究認(rèn)為細(xì)菌對四環(huán)素類抗生素產(chǎn)生耐藥性的三個主要機(jī)制都是通過質(zhì)粒介導(dǎo)的。細(xì)菌中的土霉素耐藥質(zhì)粒能夠在不同的氣單胞菌和大腸桿菌之間進(jìn)行轉(zhuǎn)移，并最終在特定的地理區(qū)域的人和水環(huán)境之間傳播。這些充分說明了抗生素的大量使用使環(huán)境不僅成為耐藥基因的儲庫，也成為耐藥基因擴(kuò)散和演化的媒介。本試驗結(jié)合目前國際上的相關(guān)報道說明了在畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)上廣泛使用的土霉素對環(huán)境有潛在的不利影響。人們在使用土霉素等抗生素藥物來預(yù)防、治療動物疾病的同時，不僅僅要考慮其對動物機(jī)體病原菌的抗藥性的影響，還要考慮隨糞便或者尿液排泄到環(huán)境中的抗生素藥物對環(huán)境可能產(chǎn)生的負(fù)面作用。致 謝本研究和實驗過程是在獸醫(yī)藥理研究室楊桂香副教授和博士研究生俞道進(jìn)同志的悉心指導(dǎo)和關(guān)懷下完成的。實驗過程還得到了高級實驗師葉啟薇老師、研究生李西瑞、吳潔珊等的關(guān)心和趙健文同學(xué)的協(xié)助。謹(jǐn)此表示最衷心的感謝！主要參考文獻(xiàn)1.陳杖榴，楊桂香，孫永學(xué)等. 獸藥殘留的毒性與生態(tài)毒理研究進(jìn)展. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2001，22（1）：8891.2.Halling-Serensen, S.Nors Nielsen, P.F.Lanzky et al. 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