果蠅實驗基礎.docx

果蠅實驗基礎實驗時間2016.11.8晚摘要：在模式生物中，最著名、“服役時間”最長、研究最深入與廣泛的當屬果蠅(Drosophila)，其中遺傳學和生物學研究中常用種為黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)。通過觀察不同種類果蠅的雌雄個體，找出雌雄個體之間的差異，掌握辨別不同種類果蠅雌雄的方法，便于后期對處女蠅的挑選與雌雄果蠅的篩選和辨別。了解果蠅幾種典型突變體黑檀體、殘翅、三隱等個體的性狀和表型，并與野生型之間進行仔細比較觀察，準確地對突變體的性狀進行識別，為進一步的雜交實驗觀察打下基礎。學習和掌握果蠅培養(yǎng)的基本方法和操作步驟。1引言在模式生物中，最著名、“服役時間”最長、研究最深入與廣泛的當屬果蠅(Drosophila)，其中遺傳學和生物學研究中常用種為黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)。果蠅是遺傳學及生物學其他學科使用最廣泛的模式生物，并對現(xiàn)代生物學的發(fā)展產生了重大的影響。這是因為果蠅作為遺傳學或或生物學的研究材料具有很多突出的優(yōu)點：(1)果蠅染色體數(shù)目少，D.melanogaster僅有四對染色體，基因組約180Mb，約120Mb常染色質，其他為異染色質。對143.726Mb序列進行注釋發(fā)現(xiàn)了17215個基因1。基因數(shù)目相對少。(2)雌雄蠅易于區(qū)分。(3)具有許多自發(fā)的或誘發(fā)的可遺傳性突變性狀。果蠅突變量巨大，Lindsley和Zimm詳細描述了4000余種基因突變，9000余種染色體重排2。(4)世代周期短。25下約10天一代；個體小易于飼養(yǎng)，繁殖能力強，培養(yǎng)費用低廉。(5)具有巨大的多線染色體。(6)雄果蠅完全連鎖。(7)有豐富的人造遺傳工具。(8)遺傳背景清楚。2000年完成了對D.melanogaster全基因組約120Mb常染色質的測序工作3。通過觀察不同種類果蠅的雌雄個體，找出雌雄個體之間的差異，掌握辨別不同種類果蠅雌雄的方法，便于后期對處女蠅的挑選與雌雄果蠅的篩選和辨別。了解果蠅幾種典型突變體黑檀體、殘翅、三隱等個體的性狀和表型，并與野生型之間進行仔細比較觀察，準確地對突變體的性狀進行識別，為進一步的雜交實驗觀察打下基礎。學習和掌握果蠅培養(yǎng)的基本方法和操作步驟。2實驗材料2.1實驗材料2.1.1每一個學生體視顯微鏡一臺；白色塑料板或硬紙板一張；小毛筆一只，楊氏解剖針一只，不銹鋼尖頭鑷子一只，麻醉瓶(60ml廣口瓶)一個，培養(yǎng)皿一個；移蠅塞2與移蠅漏斗各一個；吹氣球或洗耳球一個；400ml或500ml冰袋兩個。2.1.2每小組野生型果蠅(D.melanogaster)及突變體原種一套(裝在一個塑料筐里)；濾紙條若干；2.1.3整個實驗班培養(yǎng)瓶；海綿塞；配置培養(yǎng)基所需的藥品；量杯；定量移液槍(量程15ml)及吸頭；玻璃棒，小燒杯。2.2實驗步驟2.2.1果蠅麻醉及其觀察的方法選擇親蠅進行雜交或觀察果蠅的性狀，都要先將果蠅麻醉，使之處于不活動狀態(tài)。采用冰袋麻醉法麻醉果蠅。在冰袋上放置麻醉瓶，輕拍麻醉瓶壁使果蠅掉落在麻醉瓶底部，等待果蠅完全失去活動能力，倒出到墊有濾紙的另一個冰袋上，濾紙可以沾少許水使其不到處移動。2.2.2果蠅的生活周期果蠅屬完全變態(tài)昆蟲，一個完整生活周期可分為卵、幼蟲、蛹和成蟲4個明顯的時期。約10天即可產生一代。25時成蠅一般在交配一、兩天后即開始產卵。雌蠅一天產卵可達100枚，一生可產約2000枚卵，卵長約0.5mm，白色橢圓形，前端背面有一對觸絲使卵能覆在食物或瓶壁上。受精卵24小時內就可孵化成成幼蟲，幼蟲經兩次蛻皮成為三齡幼蟲。三齡期幼蟲體長可達45mm，用肉眼觀察可見其一端稍尖，上有一黑色勾狀口器，幼蟲生活4天左右開始化蛹?；记叭g幼蟲停止進食，爬到相對干燥的表面(如培養(yǎng)瓶壁)，逐漸形成一個菱形的蛹。從蛹殼中羽化出來的果蠅約12小時后即可交配4, 交配后精子可在雌蠅的受精囊中貯存一段時間，然后逐漸釋放到輸卵管中。所以，在雜交實驗中母本必須選用未交配的雌蠅(處女蠅)。了解果蠅生活史可幫助我們有效控制果蠅雜交實驗進程。例如，在雜交實驗中親蠅在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的時間不得超過10天，否則將導致親子蠅混雜。2.2.3雌雄果蠅鑒別黑腹果蠅的一個優(yōu)勢是雌雄蠅的一些表型特征區(qū)別明顯，雌雄二態(tài)易于區(qū)分，對于實驗者非常便利。雌雄蠅的辨別方法如下：大小 雌體通常比雄體大。形態(tài) 雌體腹部稍尖，較寬厚呈卵圓形；雄體腹部鈍圓，相對于窄小呈柱狀。條紋 雌體腹部背面有寬窄相近的5條黑色條紋；雄體腹背第5(A5)及A6上布滿黑色素，與A4上的條紋連接在一起形成一條寬條紋，因此腹背看起來是上部兩條窄下部一條寬且延伸至腹面的3條紋。性梳 果蠅腹足跗節(jié)共有5亞節(jié)。雌蠅第一對胸足跗節(jié)的第一二壓節(jié)基部有一性梳妝黑色鬃毛結構即為性梳。放大100倍左右可看清這一結構。雌蠅沒有性梳，不同種的性梳形態(tài)不同。性梳對雌蠅的成功交配起重要作用。雄蠅在交尾前用性梳抓牢雌性的腹部及生殖器，并展開翅膀2。性梳是鑒別雌雄蠅的可靠標志。外生殖器形態(tài)結構 這是本次實驗重點觀察內容之一。根據腹部腹面末端外生殖器結構來分辨雌雄已經是最簡單可靠的方法，尤其是當果蠅剛孵化，性梳等特征不是特別明顯時，外生殖器結構就成了十分有用的識別手段。因此同學們在觀察時務必將蠅的外生殖器結構看清楚，這在收集處女蠅時非常有幫助，同時一些體色較深的果蠅(如黑檀體),利用背部條紋識別較為困難，此時用外生殖器結構進行識別是一個較容易的方法。簡單來說，雄鷹色深，雌蠅外生殖器色淺。需要注意的是，剛孵化的雌蠅外生殖器的顏色較圖示的淺。2.2.4突變性狀的觀察 基因及染色體的改變引起表型性狀的改變。從表型上說，果蠅的突變性狀主要集中在眼睛(顏色、大小、性狀)，翅(形狀，翅脈的無有及形態(tài))，剛毛(有無、顏色、形態(tài)；剛毛是果蠅體表上較粗的毛)，體色，平衡棒(大小、形態(tài))，觸角這些方面，這也是本次實驗觀察的重點。辨明各種突變性狀，有利于我們正確選擇親本，準確地識別雜交后代中的不同子蠅的表型。殘翅果蠅對溫度敏感，其翅會隨著溫度升高逐步伸長，30下能發(fā)育出與野生型一樣的翅，25下有些個體翅也會伸長，不像典型的殘翅了，不要誤當成新突變或混雜。2.2.5果蠅的培養(yǎng)制備適合果蠅生長的培養(yǎng)基。在25時進行培養(yǎng)，24周換一次培養(yǎng)基，每一原種至少保留兩瓶，每瓶接510對種蠅。培養(yǎng)瓶上注明原種名稱、接種日期。過約一星期確認新接種的果蠅無污染、生長發(fā)育正常后再清潔原培養(yǎng)瓶。2.2.6處女蠅的收集黑腹果蠅接種后25下10天左右開始孵化，大約在第1316天羽化的果蠅數(shù)目最多，此后數(shù)量迅速減少。選擇生長良好、含有較多即將羽化的蛹的培養(yǎng)瓶，清楚瓶中所有成蠅后放回培養(yǎng)箱，8小時內從瓶中收集到的雌蠅即為處女蠅。8小時內果蠅不會交配，可據此特性靈活安排收集的時間。一個雜交實驗有510只處女蠅即可。處女蠅單獨存放在一新的培養(yǎng)瓶內35天以檢驗其“處女性”，如瓶中出現(xiàn)幼蟲則說明收集失敗，需重新收集。剛孵化的幼蠅，體色很淺，體節(jié)上黑色條紋不明顯，翅很短且卷曲，這種幼蠅據其腹尖腹面外生殖器形態(tài)可以清楚識別5。3結果與討論3.1突變性狀的顯隱性及基因型表示方式表 1果蠅突變性狀的顯隱性及基因型表示方式突變性狀黑檀體殘翅小翅白眼焦剛毛表示方式ebony body,eevestigial wing,vgvgminiature wing,mmwhite eye,wwsinged bristle,sn3sn3顯隱性顯性隱性隱性隱性隱性表 2表示了實驗中所選果蠅的性狀的顯隱性及其基因型表示方式。其中值得注意的是殘翅果蠅，這個性狀是溫度敏感的，其翅會隨著溫度升高逐步伸長，30下能發(fā)育出與野生型一樣的翅，25下有些個體翅也會伸長。3.2果蠅雌雄的辨別圖 1為幾種辨別果蠅雌雄的方法。圖 2A為雌蠅的腹部圖片，雌蠅腹部稍尖，較寬厚呈卵圓形，腹部背面有寬窄相近的5條黑色條紋；圖 3B為雄蠅的腹部圖片，雄蠅的腹部鈍圓，相對窄小呈柱狀，雄體腹面A5(黑色箭頭所指)及A6(紅色箭頭所指)上布滿黑色素，與A4上的條紋連接在一起形成一條寬條紋，腹面看起來像上部兩條窄下部一條寬且延伸至腹部腹面的3條紋。圖 4C為雌蠅胸足圖片，雌蠅沒有性梳，即第一對腹足跗節(jié)的第一亞節(jié)基部沒有黑色狀結構；圖 5D為雄蠅胸足圖片，雄蠅有性梳，即第一對腹足跗節(jié)的第一亞節(jié)基部有一梳狀黑色鬃毛結構(圖 6D紅圈所示結構)。圖 7E、圖 8F分別為雌、雄蠅外生殖器結構(圖中黃框所示)，雌蠅外生殖器較雄蠅外生殖器顏色較淺，雌蠅外生殖器較為光滑，而雄蠅外生殖器有很多毛狀結構。ACEBDF圖 9雌雄果蠅的辨別3.3突變性狀的觀察圖 10A為殘翅個體(圖示為雌蠅)，殘翅個體的翅相對野生型(圖 11E)個體(圖示為雄蠅)完整的翅，翅有殘缺，基本只能看見翅基部。圖 12B黑檀體個體(圖示為雄蠅)，相對于野生型(圖 13E)個體，黑檀體的體色為黑檀色。圖 14C三隱個體(圖示為雌蠅)，三隱個體眼睛顏色(黑色箭頭所示)不同于野生型(圖 15D)紅眼，為明顯的白色；體表剛毛(紅色箭頭所示)類型為焦剛毛，而野生型為直剛毛；翅相對野生型有所卷曲(黃色箭頭所示)，表現(xiàn)為小翅。表 2對突變體及野生型的性狀進行了匯總比較。ABCDE圖 16突變體及野生型性狀表 2突變體及野生型性狀比較突變性狀突變體眼睛翅型剛毛體色野生型紅眼正常翅直剛毛正常殘翅紅眼殘翅直剛毛正常黑檀體紅眼正常翅直剛毛黑檀三隱性白眼小翅焦剛毛正常參考文獻1 /genome/genomes/47?.2 Lindsley DL, Zimm GG. 1992. The genome of Drosophila melanogaster. San Diego: Academic press, Inc.3 Adams MD, Celniker SE, Holt RA, Evans CA. et al. 2000. The genome sequence of Drosophila melanogaster. Scien