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mRNA差別顯示技術(shù) 方玉兵09111082 生物技術(shù)二班 mRNA差別顯示技術(shù) 主要內(nèi)容 一 概述 mRNA差別顯示技術(shù) 高等生物大約有3 5萬個(gè)不同的基因 在每一個(gè)正常的體細(xì)胞中都含有相同的基因組拷貝 但在不同的組織細(xì)胞中僅有10 20 的少部分基因被選擇性表達(dá) 這種選擇性表達(dá)是在發(fā)育過程中細(xì)胞分化的根本原因 是調(diào)控細(xì)胞生命活動(dòng)過程的核心機(jī)制 因此 比較不同組織之間 或相同組織在不同生理?xiàng)l件下 或胚胎在不同的發(fā)育階段的基因表達(dá)差異 可分離并克隆出這些特異性表達(dá)的基因 近年來 該領(lǐng)域的研究取得了很大進(jìn)展 扣除雜交 subtractivehybridization SH 基因芯片技術(shù) DNAchiptechnique 基因表達(dá)的系統(tǒng)分析 serialanalysisofgeneexpression SAGE 噬菌體全套抗體庫技術(shù) phagedisplayantibodyrepertoirelibrarytechnique 和雙向電泳技術(shù) two dimensionalgelelectrophoresis 先后成功地建立 mRNA差異顯示PCR技術(shù)是1992年建立起來的一種RNA指紋技術(shù) 是目前篩選差異表達(dá)基因最有效的方法 可以提供生理狀態(tài)下細(xì)胞的即時(shí)信息 揭示基因調(diào)控在RNA水平的結(jié)果 它通過比較細(xì)胞對(duì)某一因素作用前后在RNA水平的差別 確定在基因水平上細(xì)胞對(duì)某些因素作用后的分子機(jī)制 二 基本概念 1992年 Liang和Padee建立了以PCR為基礎(chǔ)的mRNA差異顯示技術(shù) differentialdisplayreversetranscriptionpolymerasechainreaction DDRT PCR 它是將mRNA反轉(zhuǎn)錄技術(shù)與PCR技術(shù)二者相互結(jié)合發(fā)展起來的一種RNA指紋圖譜技術(shù) 目前已廣泛應(yīng)用于分離鑒定組織特異性表達(dá)的基因 2 RNA指紋 RNA首先在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下使RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA 之后以其DNA為模板 通過以DNA指紋技術(shù)建立指紋圖譜進(jìn)行分析 3 DNA指紋 某些DNA序列的差異可通過限制性酶切片段長度的改變反映出來 此即限制性片段長度多態(tài)性 RFLP 其主要原因是由于DNA序列個(gè)別堿基的突變而引起某個(gè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的獲得或丟失 表現(xiàn)為不同長度的酶切片段 mRNA差別顯示技術(shù) Jeffreys等用肌紅蛋白基因的一個(gè)內(nèi)含子的串聯(lián)重復(fù)序列作探針 從人的基因文庫中篩選出8個(gè)含有串聯(lián)重復(fù)序列的重組克隆 序列分析表明 這8個(gè)小衛(wèi)星重復(fù)單位的長度和序列不完全相同 但都有相同的核心序列 他們先后用兩個(gè)小衛(wèi)星探針進(jìn)行Souther雜交 在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交圖譜的帶型千差萬刷 如人的指紋一樣 Jeffreys稱之為DNA指紋或遺傳指紋 DNA指紋圖 圖為41個(gè)紅花檵木品種嫩葉DNA 紅花檵木為我國特產(chǎn)的一種優(yōu)良園林綠化觀賞植物 DNA指紋的應(yīng)用 在80年代中期興起DNA指紋技術(shù)和RNA指紋技術(shù) 目前此技術(shù)已廣泛應(yīng)用于遺傳育種 基因鑒定 連鎖分析 罪犯鑒別 疾病早期診斷 基因調(diào)控等方面的研究 4 基因差異表達(dá) 基因表達(dá)調(diào)控的一種方式 指在對(duì)信號(hào)或誘導(dǎo)物做出應(yīng)答時(shí) 選擇表達(dá)不同的基因 或使基因的表達(dá)水平有所不同 5 基因扣除技術(shù) 也稱扣除cDNA克隆 subtractivecDNAcloning 它是通過構(gòu)建扣除文庫 subtractivelibrary 得以實(shí)現(xiàn)的 本質(zhì)是除去那些普遍共同存在的 或是非誘發(fā)產(chǎn)生的cDNA序列 從而使欲分離的目的基因的序列得到有效的富集 提高了分離的敏感性 換句話說 也就是我們?cè)谔崛〉惋L(fēng)度的mRNA或者其cDNA時(shí)是比較困難的 那么我們不用直接去提取我們的目的DNA 而是通過除去體系的其他DNA 最終達(dá)到留下我們所需DNA的目的 6 基因芯片技術(shù) 基因芯片技術(shù)也稱DNA微陣列技術(shù) DNAmicroarray 實(shí)際上就是一種大規(guī)模集成的固相雜交 是指在固相支持物上原位合成 insitusynthesis 寡核苷酸或者直接將大量預(yù)先制備的DNA探針以顯微打印的方式有序地固化于支持物表面 然后與標(biāo)記的樣品雜交 通過對(duì)雜交信號(hào)的檢測(cè)分析 得出樣品的遺傳信息 基因序列及表達(dá)的信息 由于常用計(jì)算機(jī)硅芯片作為固相支持物 所以稱為DNA芯片 基因芯片 7 基因表達(dá)系列分析 基因表達(dá)系列分析 SAGE 是通過快速和詳細(xì)分析成千上萬個(gè)EST expresssequencedtags 來尋找出表達(dá)豐富度不同的SAGE標(biāo)簽序列 在此方法中 通過限制性酶切可以產(chǎn)生非常短的cDNA 10 14bp 標(biāo)簽 并通過PCR擴(kuò)增和連接 隨后對(duì)連接體進(jìn)行測(cè)序 SAGE大大簡化和加快了3 端表達(dá)序列標(biāo)簽的收集和測(cè)序 8 噬菌體抗體庫技術(shù) 以噬菌體 主要是絲狀噬菌體 噬菌體和T4噬菌體 為載體 將抗體基因插入噬菌體編碼的外殼蛋白基因P 或P 中 在噬菌體表面以抗體 外殼蛋白融合蛋白的形成表達(dá) 經(jīng)輔助病毒感染后 借助蛋白P 的信號(hào)肽穿膜作用 進(jìn)入宿主外周基質(zhì) 在正確折疊后被包裝于噬菌體尾部 隨后攜帶表達(dá)載體的宿主菌就會(huì)釋放出帶有抗體片段的噬菌體顆粒 此抗體可以特異性識(shí)別抗原 又能夠感染宿主菌進(jìn)行再擴(kuò)增 將B細(xì)胞全套可變區(qū)基因克隆出來 組裝成噬菌體抗體的群體 則成為噬菌體抗體庫技術(shù) 9 雙向電泳技術(shù) 雙向電泳 two dimensionalelectrophoresis 是等電聚焦電泳和SDS PAGE 十二烷基磺酸鈉 聚丙烯酰胺凝膠電泳 的組合 即先進(jìn)行等電聚焦電泳 按照pI分離 然后再進(jìn)行SDS PAGE 按照分子大小 經(jīng)染色得到的電泳圖是個(gè)二維分布的蛋白質(zhì)圖 第一向進(jìn)行等電聚焦 蛋白質(zhì)沿pH梯度分離 至各自的等電點(diǎn) 隨后 再沿垂直的方向進(jìn)行分子量的分離 三 mRNA差異顯示技術(shù)的原理 利用所有真核基因的mRNA的3 端都有一段多聚腺苷酸poly A 尾結(jié)構(gòu)的特點(diǎn) 將不同來源的總mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 此cDNA合成是采用oligo dT 12MN為引物 其中M為A C G中的任意一種 N為A C G或T中的任意一種 共有12種oligo dT 12MN引物 其中M為錨定堿基可增大引物的Tm值 N稱為分類堿基 對(duì)反轉(zhuǎn)錄進(jìn)行分類 用這12種引物分別對(duì)同一總mRNA樣品進(jìn)行cDNA合成 即進(jìn)行12次不同的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 得到12種類型的cDNA 從而也將總mRNA分為12個(gè)亞群 在此基礎(chǔ)上對(duì)每一類cDNA進(jìn)行隨機(jī)引物和相應(yīng)的反轉(zhuǎn)錄引物PCR擴(kuò)增 由于擴(kuò)增的cDNA片段被放射性同位素標(biāo)記 因而利用放射自顯影技術(shù)通過對(duì)不同組織樣品的同一類cDNA的PCR選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析 從而反映出不同樣品間基因的時(shí)間和空間上的組織特異性的表達(dá) mRNA差異顯示技術(shù)簡略流程圖 放射性自顯影技術(shù)的概念 放射性自顯影法與普通照相的曝光 顯影 定影原理相似 此法是利用放射性同位素所放出之射線使照相乳膠 感光 再經(jīng)顯影和定影處理 將乳膠中因受輻照而致敏的鹵化銀顆粒還原成金屬銀 洗去未 感光 的鹵化銀后則圖像自然顯示出來 圖像中任何區(qū)域的黑度取決于留存的金屬銀的量 它反映了射線在這個(gè)區(qū)域所沉積的能量 記錄 檢查和測(cè)量整體和組織 細(xì)胞和亞細(xì)胞水平中放射性示蹤物的分布 進(jìn)行定性和半定量測(cè)定 稱為放射自顯影法 mRNA差別顯示技術(shù)應(yīng)用的優(yōu)勢(shì) 第一 實(shí)驗(yàn)要求的樣品的用量較少 0 1 0 5 g 第二 因?yàn)榇思夹g(shù)程序里包括PCR擴(kuò)增步驟 因而更靈敏地用于檢測(cè)在組織或細(xì)胞中表達(dá)豐度極低的mRNA樣品的差異表達(dá) 第三 因?yàn)閺膬煞N或更多的特定組織樣品來源的擴(kuò)增產(chǎn)物在同一塊膠上鑒定 因此能用于鑒定特定組織或細(xì)胞來源樣品之間轉(zhuǎn)錄水平的mRNA的定性和定量變化 第四 能夠檢測(cè)那些彼此密切相關(guān)的RNA分子之間的表達(dá)方面的差異 而這種RNA分子的有些種類在構(gòu)建消減cDNA文庫時(shí)已經(jīng)丟失 每種技術(shù)的誕生都不可能是完美的 mRNA差異顯示技術(shù)雖然從創(chuàng)立時(shí)起就很受歡迎 但是許多研究者發(fā)現(xiàn)該技術(shù)存在一定缺陷 其中三點(diǎn)較為突出 第一 操作步驟多 外源DNA污染嚴(yán)重而導(dǎo)致假陽性率高 即差異片斷用Northern雜交時(shí)無陽性信號(hào) 重復(fù)穩(wěn)定性較差 據(jù)研究 這種假陽性率可高達(dá)70 第二 獲得的差異條帶短小 多為300bp左右 并且多為3 端非編碼區(qū)序列 UTR 難以直接判斷其功能和意義 第三 必須采用放射性同位素標(biāo)記反應(yīng) 使得實(shí)驗(yàn)周期長 成本高 易造成同位素污染 且不好回收差異片斷 mRNA差別顯示技術(shù)的缺陷 mRNA差異顯示技術(shù)現(xiàn)在已經(jīng)成功運(yùn)用于動(dòng)物的胚胎發(fā)育 組織分化 生長因子激活與抑制 細(xì)胞周期控制 癌變及疾病相關(guān)基因的鑒定和克隆 在植物無性繁殖 形態(tài)發(fā)生 次生代謝 抗逆抗病等方面被用來進(jìn)行基因的鑒定 克隆以及功能研究 并取得很好的結(jié)果 概括起來其主要用途可以歸納為以下三點(diǎn) 第一 尋找差異表達(dá)的基因 第二 研究個(gè)體 種群或品種間轉(zhuǎn)錄水平上的遺傳變異 第三 鑒定經(jīng)濟(jì)動(dòng)物中控制重要數(shù)量經(jīng)濟(jì)性狀位點(diǎn)的基因 四 mRNA差異顯示技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用 由于人們認(rèn)識(shí)的基因還不夠全面 特別是對(duì)生物發(fā)生 發(fā)育及病理生理過程中某些新的功能基因和調(diào)控作用認(rèn)識(shí)不足 因此差異顯示技術(shù)將在研究生物進(jìn)化 損傷修復(fù) 癌變及治療反應(yīng)過程中具有重要意義 差顯技術(shù)的發(fā)現(xiàn)為在該領(lǐng)域中尋找新基因提供了有用的工具 相信隨著不斷的應(yīng)用和技術(shù)的不斷改善 差異顯示技術(shù)必越來越多的在生命科學(xué)以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)