PCR引物的設(shè)計(jì)原則.doc

PCR引物的設(shè)計(jì)原則： 引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性。 產(chǎn)物不能形成二級結(jié)構(gòu)。 引物長度一般在1530堿基之間。 G+C含量在40%60%之間。 堿基要隨機(jī)分布。 引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補(bǔ)。 引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補(bǔ)。 引物5端可以修飾。 引物3端不可修飾。 引物3端要避開密碼子的第3位。1.引物的特異性 引物與非特異擴(kuò)增序列的同源性不要超過70%或有連續(xù)8個互補(bǔ)堿基同源。2.避開產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)區(qū) 某些引物無效的主要原因是引物重復(fù)區(qū)DNA二級結(jié)構(gòu)的影響，選擇擴(kuò)增片段時(shí)最好避開二級結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)計(jì)算機(jī)軟件可以預(yù)測估計(jì)mRNA的穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)，有助于選擇模板。實(shí)驗(yàn)表明，待擴(kuò)區(qū)域自由能（G）小于58.6lkJ/mol時(shí)，擴(kuò)增往往不能成功。若不能避開這一區(qū)域時(shí)，用7-deaza-2-脫氧GTP取代dGTP對擴(kuò)增的成功是有幫助的。3.長度 寡核苷酸引物長度為1530bp，一般為1827mer。引物的有效長度：Ln=2（G+C）+（A+T），Ln值不能大于38，因?yàn)?8時(shí)，最適延伸溫度會超過Taq DNA聚合酶的最適溫度（74),不能保證產(chǎn)物的特異性。4.G+C含量 G+C含量一般為40%60%。其Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度，有效啟動溫度，一般高于Tm值510。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估計(jì)引物的Tm值，則有效引物的Tm為5580，其Tm值最好接近72以使復(fù)性條件最佳。上下游引物的GC含量不能相差太大。5.堿基隨機(jī)分布 引物中四種堿基的分布最好是隨機(jī)的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3端不應(yīng)超過3個連續(xù)的G或C，因這樣會使引物在G+C富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。6.引物自身 引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則引物自身會折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)引物本身復(fù)性。這種二級結(jié)構(gòu)會因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。若用人工判斷，引物自身連續(xù)互補(bǔ)堿基不能大于3bp。7.引物之間 兩引物之間不應(yīng)具有互補(bǔ)性，尤應(yīng)避免3端的互補(bǔ)重疊以防引物二聚體的形成。一對引物間不應(yīng)多于4個連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性。引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)如果不可避免的話，應(yīng)盡量使其G值不要過高（應(yīng)小于4.5kcal/mol）。否則易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR 反應(yīng)不能正常進(jìn)行。8.引物的3端 引物的延伸是從3端開始的，不能進(jìn)行任何修飾。3端也不能有形成任何二級結(jié)構(gòu)可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反應(yīng)中，引物3端不能發(fā)生錯配。 在標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系中，用2U Taq DNA聚合酶和800mol/L dNTP（四種dNTP各200mol/L）以質(zhì)粒（103拷貝）為模板，按95，25s；55，25s；72，1min的循環(huán)參數(shù)擴(kuò)增HIV-1 gag基因區(qū)的條件下，引物3端錯配對擴(kuò)增產(chǎn)物的影響是有一定規(guī)律的。AA錯配使產(chǎn)量下降至1/20，AG和CC錯配下降至1/100。引物A：模板G與引物G：模板A錯配對PCR影響是等同的。9.引物的5端 引物的5端限定著PCR產(chǎn)物的長度，它對擴(kuò)增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物5端修飾包括：加酶切位點(diǎn)；標(biāo)記生物素、熒光、地高辛等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入突變位點(diǎn)、插入與缺失突變序列和引入一啟動子序列等。10.密碼子的簡并 如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并，會影響擴(kuò)增特異性與效率。11. 引物3端不能選擇A，最好選擇T。 引物3端錯配時(shí)，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異，當(dāng)末位的堿基為A時(shí)，即使在錯配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當(dāng)末位鏈為T時(shí)，錯配的引發(fā)效率大大降低，G、C錯配的引發(fā)效率介于A、T之間，所以3端最好選擇T。12. 引物5 端和中間G值應(yīng)該相對較高，而3 端G值較低。 G值是指DNA 雙鏈形成所需的自由能，它反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性，G值越大，則雙鏈越穩(wěn)定。應(yīng)當(dāng)選用5 端和中間G值相對較高，而3 端G值較低（絕對值不超過9）的引物。引物3 端的G 值過高，容易在錯配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)。（不同位置的G值可以用Oligo 6軟件進(jìn)行分析）13. 引物應(yīng)具有特異性。 引物設(shè)計(jì)完成以后，應(yīng)該對其進(jìn)行BLAST檢測。如果與其它基因不具有互補(bǔ)性，就可以進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)了。關(guān)于BLAST（使用方法以后將會講解）的作用應(yīng)該是通過比對，發(fā)現(xiàn)你所設(shè)計(jì)的這個引物，在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并在GENBANK中公開的不物種基因序列當(dāng)中，除了和你的目標(biāo)基因之外，還有沒有和其他物種或其他序列當(dāng)中存在相同的序列，如和你的目標(biāo)序列之外的序列相同的序列，則可能擴(kuò)出其他序列的產(chǎn)物，那么這個引物的特異性就很差，